鈣蛋白酶在嚴(yán)重?zé)齻笫蠊趋兰∠闹械淖饔眉皺C(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體處于物質(zhì)能量高分解代謝狀態(tài),作為人體最大氮庫(kù)的骨骼肌是受分解代謝影響最大的器官,致傷后極長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)骨骼肌會(huì)陷入嚴(yán)重的消耗狀態(tài)。骨骼肌嚴(yán)重消耗將導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,感染率增加等,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。我們實(shí)驗(yàn)室既往研究表明,嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠闹饕从诜核?蛋白酶體活化引發(fā)的肌原纖維蛋白降解增加。然而,泛素-蛋白酶體途徑不能直接降解肌原纖維蛋白,而有賴于鈣蛋白酶( calcium-activat

2、ed neutral protease,calpain)等其它途徑作用產(chǎn)生可被泛素-蛋白酶體降解的蛋白。鈣蛋白酶是細(xì)胞內(nèi)依賴鈣的中性半胱氨酸酶,通過Ca2+激活進(jìn)而表現(xiàn)出蛋白水解酶活性。新近研究表明,鈣蛋白酶在許多高代謝病理狀態(tài)引發(fā)的骨骼肌消耗中起著重要作用。為進(jìn)一步闡明嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠牡臋C(jī)制,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),本研究擬通過嚴(yán)重?zé)齻麆?dòng)物模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討:
　　(1)嚴(yán)重?zé)齻笫蠊趋兰∠?、骨骼肌超微結(jié)構(gòu)及鈣蛋白酶活

3、性變化規(guī)律;
　　(2)鈣蛋白酶活化導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)齻笫蠊趋兰∠牡淖饔脵C(jī)制;
　　(3)嚴(yán)重?zé)齻蟠笫蠊趋兰♀}蛋白酶活化的原因;
　　(4)鈣離子泵抑制劑丹曲林對(duì)嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠牡挠绊懠俺醪綑C(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:
　　(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))雄性Wistar大鼠80只(180~210g),隨機(jī)分為假燙組(n=40)和燙傷組(n=40),背部浸入94℃熱水12s、腹部6s制備50％體表面積(total

4、 body area surface,TBSA)III度燙傷動(dòng)物模型。于傷后0d、1d、4d、7d、14d(n=8)五個(gè)觀察點(diǎn),采集腹主動(dòng)脈血和骨骼肌標(biāo)本。采用大鼠體重、大鼠肌肉重量/體重比評(píng)估燙傷大鼠骨骼肌消耗情況;透射電鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化;實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)calpain-1及calpain-2表達(dá)水平;Western blot免疫印跡檢測(cè)脛骨前肌中 calpain-1、calpain-2蛋白表達(dá)水平;熒光定量檢測(cè)鈣蛋白酶

5、活性。
　　第二部分:
　　(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))雄性Wistar大鼠72只隨機(jī)分為3組,假燙組(n=24)、燙傷組(n=24)和抑制劑組(n=24)。燙傷組和抑制劑組制備50%TBSAIII度燙傷。傷后抑制劑組采用腹腔注射MDL28170(鈣蛋白酶抑制劑,24mg/kg)給藥,1/24h。假燙組和燙傷組大鼠給予等量溶液(2%DMSO的林格氏液)。傷后1d、7d、14d(n=8)三個(gè)觀察點(diǎn)采集脛骨前肌標(biāo)本。采用大鼠體重、大鼠肌肉重量/

6、體重比評(píng)估燙傷大鼠骨骼肌消耗情況;定量檢測(cè)脛骨前肌中游離肌絲含量;SDS-PAGE分析游離肌絲中肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白的含量;熒光定量檢測(cè)骨骼肌中鈣蛋白酶、26S蛋白酶體及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性;原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(Tunel)染色檢測(cè)肌組織細(xì)胞凋亡;Western blot免疫印跡分析脛骨前肌中calpain-1、calpain-2、肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白以及蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá)水平,胞漿和線粒體中活化

7、Bid(truncated Bid,tBid)、細(xì)胞色素c(Cytochrome c, Cyt c)、calpain-2蛋白含量,以及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、糖原合成酶-3β((glycogen synthesis kinase,GSK-3β)和叉形頭轉(zhuǎn)錄因子3a(Forkhead box O3a,FoxO3a

8、)總蛋白和磷酸化蛋白水平。
　　(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌 L6細(xì)胞分為對(duì)照組、calpain-2過表達(dá)組、calpain-2過表達(dá)+抑制劑組。對(duì)照組采用含有終濃度為5mM CaCL2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng);calpain-2過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGMLV-calpain-2-PA1慢病毒3d后,用含有終濃度為5mM CaCL2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng);calpain-2過表達(dá)+抑制劑組細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒3d后,用含有5mM CaCL2和10nM

9、 MDL28170的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)0h、6h和24h后收集細(xì)胞,AnnexinV/PI染色流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;熒光定量檢測(cè)L6細(xì)胞中caspase-3活性;Western blot免疫印跡分析胞漿和線粒體中tBid、細(xì)胞色素c、calpain-2蛋白含量。
　　第三部分:
　　(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))雄性Wistar大鼠80只隨機(jī)分為假燙組(n=40)和燙傷組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=40)。傷后0d、1d、4d、7d、14

10、d五個(gè)觀察點(diǎn)(n=8),采集脛骨前肌標(biāo)本。電子探針 X射線顯微分析法檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞胞漿、線粒體、肌漿網(wǎng)三微區(qū)內(nèi)Ca2+含量;實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)脛骨前肌中鈣蛋白酶激活蛋白和鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastin) mRNA水平;Western blot免疫印跡分析calpastin蛋白表達(dá);熒光定量檢測(cè)骨骼肌中鈣蛋白酶活性。
　　(細(xì)胞實(shí)驗(yàn)) L6細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組,對(duì)照組細(xì)胞用含有10%假傷大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基孵育、

11、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用含10%燙傷大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基孵育。孵育0h、6h、24h、48h后,Fluo4-AM檢測(cè)細(xì)胞胞漿中Ca2+濃度,熒光定量檢測(cè)L6細(xì)胞中鈣蛋白酶活性。
　　第四部分:
　　(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))雄性Wistar大鼠56只隨機(jī)分為假燙組(n=8)、燙傷組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=24)和丹曲林組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=24)。傷后假燙組、燙傷組尾靜脈注射5%甘露醇,丹曲林組尾靜脈注射丹曲林鈉2 mg/kg(溶

12、于5%甘露醇),傷后1d、4d、7d三個(gè)觀察點(diǎn)采集脛骨前肌標(biāo)本,稱量體重及骨骼肌重量。透射電鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化;電子探針 X射線顯微分析法檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞三微區(qū)內(nèi) Ca2+含量;Western blot免疫印跡分析脛骨前肌中 calpain-1、calpain-2蛋白表達(dá);熒光定量檢測(cè)骨骼肌中鈣蛋白酶活性。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　(1)50%TBSA III度燙傷后大鼠體重以及脛骨前肌(快肌)重量明顯降低

13、,燙傷組脛骨前肌/體重比明顯低于假燙組(P<0.05),傷后7d最為顯著;
　　(2)傷后燙傷組骨骼肌肌原纖維出現(xiàn)溶解、斷裂、Z線局部消失,并伴有線粒體腫脹和空泡化現(xiàn)象,與肌組織損傷動(dòng)態(tài)變化基本一致;
　　(3)傷后燙傷組大鼠脛骨前肌calpain-1和calpain-2蛋白及mRNA表達(dá)水平均升高,其中蛋白水平于傷后4d達(dá)到峰值;
　　(4)傷后鈣蛋白酶的活性持續(xù)上升,于傷后7d達(dá)到峰值。
　　第二部分:

14、>　　(1)燙傷后大鼠脛骨前肌游離肌絲明顯增加,肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白含量顯著增加,鈣蛋白酶活性升高,傷后7d達(dá)到極值。應(yīng)用鈣蛋白酶抑制劑后脛骨前肌游離肌絲未見明顯增加,肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白含量顯著低于燙傷組,鈣蛋白酶活性一直處于較低水平;
　　(2)嚴(yán)重燙傷后脛骨前肌中26S蛋白酶體活性及C2亞基蛋白表達(dá)升高,顯著高于假燙組。加入鈣蛋白酶抑制劑后,26S蛋白酶體活性及 C2亞基蛋白表達(dá)與同時(shí)間點(diǎn)燙傷組相比明顯下降;

15、
　　(3)燙傷組骨骼肌 Tunel核凋亡指數(shù)、caspase-3活性顯著高于假燙組,傷后7d差異最為顯著,給予鈣蛋白酶抑制劑后,肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3活性明顯低于燙傷組。燙傷組和抑制劑組脛骨前肌胞漿和線粒體中 calpain-2蛋白表達(dá)均顯著升高,但同時(shí)間點(diǎn)抑制劑組蛋白表達(dá)低于燙傷組;傷后各組胞漿中 Bid蛋白表達(dá)差異不顯著,但線粒體中tBid蛋白表達(dá)存在顯著差異,傷后1d、7d燙傷組線粒體中tBid蛋白表達(dá)顯著

16、升高,抑制劑組tBid蛋白表達(dá)明顯低于燙傷組;細(xì)胞色素 c蛋白在假燙組和抑制劑組脛骨前肌胞漿中表達(dá)較少,燙傷后隨時(shí)間延長(zhǎng)燙傷組胞漿中細(xì)胞色素c蛋白含量顯著升高,傷后7d燙傷組胞漿中細(xì)胞色素c含量顯著高于假燙組和抑制劑組,同時(shí)線粒體中細(xì)胞色素c含量明顯減少,傷后7d燙傷組線粒體中細(xì)胞色素c含量顯著低于假燙組和抑制劑組。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中calpain-2過表達(dá)的 L6細(xì)胞凋亡率和 caspase-3活性顯著升高,與對(duì)照組差異顯著,抑制劑組細(xì)胞

17、凋亡率和caspase-3活性略有升高,但低于過表達(dá)組。過表達(dá)組和抑制劑組胞漿中calpain-2蛋白表達(dá)沒有顯著差異,但過表達(dá)組細(xì)胞線粒體內(nèi)calpain-2隨著孵育時(shí)間的增加而升高,顯著高于抑制劑組;L6細(xì)胞線粒體及胞漿內(nèi)tBid含量與calpain-2蛋白的變化趨勢(shì)相似。過表達(dá)組L6細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素c蛋白含量逐漸降低,胞漿中細(xì)胞色素c蛋白的逐漸升高,24h后達(dá)到極值。抑制劑組中細(xì)胞胞漿及線粒體中細(xì)胞色素c蛋白變化趨勢(shì)同過表達(dá)組

18、,但兩組存在顯著差異;
　　(4)嚴(yán)重?zé)齻竺劰乔凹≈蠥kt、mTOR、GSK-3β和FoxO3a蛋白的磷酸化水平顯著降低,給予鈣蛋白酶抑制劑后,傷后1d和7d的 Akt、mTOR、GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著高于燙傷組。
　　第三部分:
　　(1)燙傷組大鼠傷后脛骨前肌細(xì)胞漿、線粒體 Ca2+升高,肌漿網(wǎng)Ca2+含量降低,傷后1d Ca2+變化達(dá)到極值。燙傷組calpastatin mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低后升高

19、的趨勢(shì),傷后1d和4d的 calpastatin mRNA水平明顯低于假燙組,燙傷組calpain activator的mRNA傷后略有變化,與假燙組沒有顯著差異。傷后脛骨前肌中 calapastatin蛋白表達(dá)下降,傷后4d顯著低于假燙組;
　　(2)燙傷血清孵育L6細(xì)胞引起胞漿內(nèi)Ca2+含量升高,隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng),Ca2+含量增加,鈣蛋白酶活性升高。
　　第四部分:
　　(1)鈣通道RyR受體阻滯劑丹曲林明顯抑制細(xì)

20、胞胞漿及線粒體內(nèi)Ca2+超載,丹曲林組傷后1d、4d細(xì)胞胞漿、線粒體內(nèi) Ca2+含量明顯低于燙傷組;
　　(2)丹曲林組傷后肌組織超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比未見明顯變化;
　　(3)calpain-1和calpain-2蛋白表達(dá)水平顯著低于燙傷組;
　　(4)丹曲林組鈣蛋白酶的活性雖有略有波動(dòng),但仍顯著低于燙傷組。丹曲林治療有效降低骨骼肌消耗,緩解燒傷導(dǎo)致的體重及脛骨前肌/體重比變化。
　　結(jié)論:
　　(1)嚴(yán)重

21、燒傷后鈣蛋白酶活化是嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠牡闹匾?。活化的鈣蛋白酶可通過裂解肌原纖維、釋放游離肌絲、上調(diào)下游泛素-蛋白酶體途徑的活性,啟動(dòng)和加速蛋白降解;活化的鈣蛋白酶激活線粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡;同時(shí)鈣蛋白酶還通過抑制 Akt活性及其信號(hào)通路下游分子磷酸化,抑制蛋白合成、促進(jìn)骨骼肌消耗。
　　(2)細(xì)胞內(nèi)持續(xù)Ca2+超載及鈣蛋白酶抑制蛋白低表達(dá)是嚴(yán)重燙傷后骨骼肌胞漿內(nèi)的鈣蛋白酶活化的主要原因。
　　(3)鈣蛋白酶抑制劑(