嚴(yán)重?zé)齻笫蠊趋兰〉蛲黾耙葝u素治療對(duì)其作用的研究.pdf

1、目的：嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∥s可引起許多并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的治療、康復(fù)及預(yù)后。我們以前的研究表明，骨骼肌蛋白降解增強(qiáng)是燒傷后骨骼肌萎縮的重要原因。然而最近的研究表明，細(xì)胞凋亡通路的激活在骨骼肌萎縮過程中具有重要作用并且發(fā)生在骨骼肌蛋白降解之前，而且線粒體功能失常和細(xì)胞凋亡通路失調(diào)已被認(rèn)為是老年因素等引起的骨骼肌萎縮發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。本研究擬進(jìn)一步探討嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰〉蛲龅陌l(fā)生、成肌細(xì)胞增殖活性的改變以及它們與骨骼肌萎縮的關(guān)系；燒傷后骨骼肌

2、凋亡的可能機(jī)制；胰島素對(duì)燒傷后骨骼肌凋亡的抑制作用及其機(jī)制。為了避免熱力損傷對(duì)骨骼肌的直接作用，并能更好地理解燒傷后全身系統(tǒng)反應(yīng)對(duì)骨骼肌的作用，我們選取遠(yuǎn)離燒傷部位的脛骨前肌作為研究對(duì)象。
　　 方法：雄性Wistar大鼠180只，隨機(jī)分為3組：(1)假傷組；(2)嚴(yán)重?zé)齻M制作40％TBSA大鼠燙傷模型；(3)燒傷+胰島素治療組從燒傷后24小時(shí)開始，每隔12小時(shí)皮下注射胰島素1次，持續(xù)5天(劑量逐日遞增，分別為0.25，0.5

3、，0.75，1.0，1.25 U/100g/次)。于傷后0、1、4、7、10、14天麻醉大鼠，麻醉前夜禁食，腹主動(dòng)脈抽血并分離切取脛骨前肌及趾長(zhǎng)伸肌并稱重。胰島素治療組取標(biāo)本時(shí)間為胰島素注射后8分鐘。骨骼肌凋亡的超微結(jié)構(gòu)采用透射電鏡(TEM)檢測(cè)；骨骼肌凋亡的原位檢測(cè)采用TdT酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)；骨骼肌凋亡的定量及血清TNF-α、sFas、sFasL水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)；血清胰島素水平采

4、用放射免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)；血糖水平采用Roche血糖儀進(jìn)行檢測(cè)；骨骼肌凋亡相關(guān)基因的表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量PCR芯片進(jìn)行檢測(cè)；骨骼肌中Akt(蛋白激酶B)及磷酸化Akt、Bax、Bcl-2、Apaf-1和caspase-3蛋白表達(dá)水平采用Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)；骨骼肌caspase-3、caspase-8、caspase-9活性水平采用相應(yīng)試劑盒通過比色法或化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.嚴(yán)重?zé)齻?/p>

5、引起大鼠體重明顯降低，脛骨前肌和趾長(zhǎng)伸肌的肌肉重量下降、肌肉重量與體重比值減小。
　　 2.嚴(yán)重?zé)齻蟠笫竺劰乔凹〕杉〖?xì)胞增殖活性(PCNA表達(dá))明顯降低，但經(jīng)線性相關(guān)分析未發(fā)現(xiàn)與肌肉重量有顯著相關(guān)。
　　 3.嚴(yán)重?zé)齻蟠笫竺劰乔凹〈嬖诩『说蛲霈F(xiàn)象，經(jīng)線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)脛骨前肌凋亡指數(shù)與肌肉重量呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　 4.嚴(yán)重?zé)齻笱錞NF-α迅速升高并逐漸下降，隨后血清sFasL與sFas比值升高。
　

6、　 5.嚴(yán)重?zé)齻笏劳鍪荏w通路中的促凋亡信號(hào)分子，包括TNF-α、FasL、Tnfrsfla、Tnfrsflb、Tnfsf6、Fadd、caspase-3、caspase-6和caspase-8均表達(dá)增高或活性增強(qiáng)。
　　 6.嚴(yán)重?zé)齻缶€粒體通路中的促凋亡分子Bax、Bid、Apaf-1和caspase-9表達(dá)或活性增強(qiáng)，而抗凋亡分子Bnip1表達(dá)下調(diào)。另外抗凋亡基因Bcl211和Mcl1等表達(dá)也上調(diào)。
　　 7.嚴(yán)

7、重?zé)齻笃渌盘?hào)通路中的促凋亡分子，如Gadd45a、Cidea、Dapk1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)部分抗凋亡基因ARC/Nol-3、IL-10、prokineticin-2也表達(dá)上調(diào)。
　　 8.胰島素治療可部分抑制燒傷引起的脛骨前肌凋亡增加。
　　 9.胰島素治療后燒傷大鼠脛骨前肌胰島素信號(hào)通路中的核心信號(hào)蛋白Akt磷酸化水平顯著升高，血清胰島素水平升高。
　　 10.胰島素治療后燒傷大鼠血清TNF-α及sFasL和s

8、Fas比值下降。11.胰島素治療后，燒傷大鼠骨骼肌促凋亡分子包括TNF受體超家族中的Traf1，Bcl-2家族中的Bid3，caspase家族中的caspase-3和caspase-6，CARD家族中的Card6、Dapk1和Cidea基因/蛋白表達(dá)或活性水平下降。同時(shí)抗凋亡基因Prok2表達(dá)也下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.嚴(yán)重?zé)齻蟠嬖诠趋兰『说蛲霈F(xiàn)象，它是燒傷后骨骼肌萎縮的重要原因。
　　 2.嚴(yán)重?zé)齻蠊?/p>

9、骼肌成肌細(xì)胞增殖活性下降，但它可能不是骨骼肌萎縮的主要原因。
　　 3.嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰〉蛲龅臋C(jī)制包括外源性通路(死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路)、內(nèi)源性通路(線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路)以及其它信號(hào)通路中與凋亡相關(guān)的分子的活化。
　　 4.胰島素治療可部分抑制燒傷引起的脛骨前肌凋亡增加，其機(jī)制是通過激活胰島素信號(hào)通路來調(diào)節(jié)包括死亡受體信號(hào)通路分子、caspases、Bcl-2家族調(diào)節(jié)蛋白及其它與凋亡相關(guān)的信號(hào)分子，從