膜粘連蛋白Ⅱ在顱腦創(chuàng)傷后急性期與慢性期中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分膜粘連蛋白Ⅱ通過(guò)保護(hù)血腦屏障對(duì)小鼠顱腦創(chuàng)傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　目的：
　　評(píng)估外源性重組 A2對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后早期神經(jīng)功能預(yù)后以及血腦屏障的影響，探討A2作為腦創(chuàng)傷治療靶點(diǎn)的可能性。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：內(nèi)源性 A2蛋白在 CCI后不同時(shí)間點(diǎn)和不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化
　　在成年雄性小鼠上建立精確皮質(zhì)打擊模型，檢測(cè)傷前與傷后不同時(shí)間點(diǎn)（6小時(shí)，1天，3天，5天，7天，14天，21天）傷側(cè)

2、半球腦組織A2蛋白的表達(dá)；用CD31、GFAP、NeuN分別標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，再與A2抗體行雙重染色檢測(cè)傷后A2在不同細(xì)胞類型中表達(dá)的變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)二：外源性A2蛋白對(duì)CCI后BBB通透性、腦水腫以及海馬神經(jīng)元存活的影響
　　體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞并建立損傷模型，檢測(cè) rA2對(duì)傷后內(nèi)皮細(xì)胞電阻、內(nèi)皮細(xì)胞屏障通透性和內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響；小鼠 CCI傷后通過(guò)靜脈注射伊文思藍(lán)染料并測(cè)定半球染料含量，檢測(cè)rA2對(duì)B

3、BB通透性的影響；通過(guò)干濕重法測(cè)定傷后大腦半球組織含水量，檢測(cè) rA2對(duì)傷后腦水腫的影響；免疫組織熒光對(duì) CCI后海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記并定量，檢測(cè) rA2傷后海馬神經(jīng)元存活的影響；給予離體缺氧處理的神經(jīng)元中加入內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，檢測(cè) rA2通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)受損神經(jīng)元的細(xì)胞活力影響。
　　實(shí)驗(yàn)三：外源性 A2蛋白對(duì) CCI后早期神經(jīng)功能恢復(fù)和傷灶體積的影響
　　通過(guò)NSS評(píng)分、Wire-gripping實(shí)驗(yàn)分別對(duì)CCI傷后小鼠

4、進(jìn)行檢測(cè)，觀察rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響；對(duì)CCI傷后小鼠的組織切片進(jìn)行HE染色，觀察rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后傷灶體積的影響。
　　實(shí)驗(yàn)四：外源性A2蛋白對(duì)腦損傷后BBB保護(hù)作用的機(jī)制
　　通過(guò)明膠酶譜法，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后腦組織MMP-9活性的影響；通過(guò)對(duì)傷側(cè)腦組織中蛋白質(zhì)定量，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后VEGF、Occludin、Claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響；建立體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)rA2對(duì)內(nèi)皮細(xì)

5、胞應(yīng)力纖維形成的影響。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：從傷后3天起，A2表達(dá)明顯增高（P<0.05），并在7天時(shí)達(dá)到高峰（P<0.05）。此后，蛋白表達(dá)逐漸下降，21天時(shí)恢復(fù)到基值。對(duì)比傷前與傷后免疫組織熒光結(jié)果，傷前內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)A2，傷后在傷側(cè)部分內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) A2；傷前星形膠質(zhì)細(xì)胞部分表達(dá) A2，傷后雙側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞均有活化，且活化的膠質(zhì)細(xì)胞都能表達(dá)A2；神經(jīng)元細(xì)胞在傷前已有A2表達(dá)，傷后未見(jiàn)明顯改變。
　　實(shí)驗(yàn)二：在

6、內(nèi)皮細(xì)胞損傷后rA2能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞電阻（P<0.05）和細(xì)胞活力（P<0.05），并降低FITC-dextran通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞屏障的數(shù)量（P<0.05）；通過(guò)在傷后不同時(shí)間點(diǎn)（2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)）將不同劑量rA2（0.75mg/kg，1mg/kg，1.5mg/kg）通過(guò)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，均能顯著降低傷后腦組織EB滲出量（P<0.05）；給予rA2不能顯著改變傷后腦組織水腫狀況（P>0.05）；rA2能顯著減少傷后7天 CA1和C

7、A3區(qū)神經(jīng)元丟失，減輕海馬區(qū)結(jié)構(gòu)破壞（P<0.05）；給予rA2的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基能顯著提高缺氧損傷神經(jīng)元的活力（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)三：NSS評(píng)分結(jié)果證實(shí)rA2能顯著提高傷后7天內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)（P<0.05），Wire-gripping實(shí)驗(yàn)中rA2組小鼠的表現(xiàn)與對(duì)照組無(wú)顯著差別（P>0.05）；HE染色證實(shí)給予 rA2后傷灶體積無(wú)明顯改變（P>0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四：rA2對(duì)傷后7天小鼠腦組織 MMP-9活

8、性無(wú)顯著影響（P>0.05）；rA2對(duì)傷后7天小鼠腦組織中VEGF、Occludin和Claudin-5表達(dá)無(wú)顯著影響（P>0.05）；rA2能顯著增加傷后7天小鼠腦組織中ZO-1表達(dá)（P<0.05）；給予rA2后受損的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力纖維數(shù)量顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在創(chuàng)傷性顱腦損傷早期，rA2能提高內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1合成，減少細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維數(shù)量，從而穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，減少BBB通透性。這種BBB的修

9、復(fù)作用能保護(hù)神經(jīng)組織，從而減少神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　第二部分膜粘連蛋白Ⅱ通過(guò)血管再生途徑對(duì)小鼠顱腦創(chuàng)傷后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　目的：
　　評(píng)估外源性重組 A2對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后長(zhǎng)期神經(jīng)功能預(yù)后的影響，同時(shí)探討A2促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：外源性A2蛋白對(duì)顱腦創(chuàng)傷后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)和傷灶體積的影響
　　通過(guò)NSS評(píng)分、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)分別將CCI傷

10、后小鼠進(jìn)行檢測(cè)，觀察rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響；對(duì)CCI傷后小鼠的組織切片進(jìn)行HE染色，觀察rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后傷灶體積的影響。
　　實(shí)驗(yàn)二：外源性A2蛋白對(duì)顱腦創(chuàng)傷后血管再生的影響及其機(jī)制
　　離體培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè) rA2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、管腔結(jié)構(gòu)形成和運(yùn)動(dòng)遷移的影響；通過(guò)CD31/Brdu標(biāo)記新生內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響；通過(guò)靜脈注射Lectin，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后功能性血管密度的影

11、響；分離傷后皮質(zhì)微血管并進(jìn)行原位酶活性檢測(cè)，比較rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后血管血纖維蛋白溶酶活性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)三：外源性A2蛋白對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)再生的影響及其機(jī)制
　　通過(guò)標(biāo)記Nestin/Brdu標(biāo)記增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響；通過(guò) NeuN/Brdu標(biāo)記新生的神經(jīng)元，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)再生的影響；通過(guò)PSA-NCAM/Brdu標(biāo)記新生的成神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè) rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后成神經(jīng)細(xì)胞遷

12、移的影響；通過(guò)對(duì)傷側(cè)腦組織中蛋白質(zhì)定量，檢測(cè) rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響；分離傷后皮質(zhì)微血管并提取mRNA，檢測(cè)rA2對(duì)顱腦創(chuàng)傷后血管內(nèi)皮內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：NSS評(píng)分、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)rA2能顯著提高傷后28天內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)（P<0.05），水迷宮實(shí)驗(yàn)中rA2組小鼠的空間記憶能力明顯優(yōu)于對(duì)照組小鼠（P<0.05）；HE染色證實(shí)給予 rA2后傷灶體積無(wú)明顯改變（P>0.

13、05）。
　　實(shí)驗(yàn)二：離體培養(yǎng)條件下，rA2能顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、管腔結(jié)構(gòu)形成與運(yùn)動(dòng)遷移能力（P<0.05）；rA2能顯著增加CCI傷后7天內(nèi)海馬和傷灶周圍內(nèi)皮細(xì)胞增殖（P<0.05）；傷后28天時(shí)，rA2組傷灶周圍皮質(zhì)功能性血管密度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但海馬區(qū)血管網(wǎng)密度無(wú)明顯變化（P>0.05）；rA2提高傷后7天皮質(zhì)微血管內(nèi)血纖維蛋白溶酶活性。
　　實(shí)驗(yàn)三：rA2對(duì)傷后早期SGZ和SVZ區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞分裂

14、增殖無(wú)顯著作用（P>0.05），但是卻能增加后期傷灶區(qū)域新生神經(jīng)元的數(shù)量（P<0.05）; rA2增加了傷后7天內(nèi)遷移至傷灶周圍以及海馬齒狀回的新生神經(jīng)元數(shù)量（P<0.05）；rA2增加傷側(cè)腦組織中 BDNF、VEGF的含量；分離傷后7天時(shí)小鼠腦組織皮質(zhì)微血管，rA2組微血管內(nèi)BDNF、VEGF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著對(duì)照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在創(chuàng)傷性顱腦損傷后，rA2能提高微血管內(nèi)血纖維蛋白溶酶活性，從而促進(jìn)