豬水腫病大腸桿菌SLT-Ⅱe基因突變菌株部分生物學(xué)特性及口服免疫效果的研究.pdf

1、豬水腫?。‥dema disease of swine，ED）是由某些溶血性大腸桿菌引起斷奶仔豬的一種毒血癥。臨床特征是頭部和胃壁等處水腫、共濟(jì)失調(diào)、驚厥和麻痹等。該病發(fā)病急、死亡快，往往來不及治療，死亡率很高。該病主要通過消化道感染，因此針對(duì)其黏膜感染的特點(diǎn)，研制有效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，進(jìn)而引起全身性系統(tǒng)免疫應(yīng)答的口服疫苗，對(duì)該病的防制具有重要意義。
　　 本研究對(duì)豬水腫病大腸桿菌SLT-Ⅱe基因突變菌株O13

2、9的部分生物學(xué)特性以及作為口服疫苗的免疫效果進(jìn)行了研究。
　　 突變菌株O139和大腸桿菌O139生長曲線測定結(jié)果顯示，突變菌株O139生長良好，與大腸桿菌O139無明顯差別。提取突變菌株O139和大腸桿菌O139的毒素，測定其對(duì)昆明鼠和vero細(xì)胞的半數(shù)致死量，大腸桿菌O139毒素對(duì)昆明鼠的半數(shù)致死量為287.17μg/ml，對(duì)vero細(xì)胞的半數(shù)致死量為0.547μg/ml，而突變菌株O139毒素對(duì)昆明鼠和vero細(xì)胞無致病性

3、，結(jié)果表明突變菌株O139毒素毒性明顯低于大腸桿菌O139毒素毒性。
　　 突變菌株O139在不含萘啶酮酸（Nal）的LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳50代后，用PCR和酶切方法對(duì)第50代突變菌株O139的SLT-Ⅱe*基因序列進(jìn)行鑒定并測序，結(jié)果與第1代突變菌株O139的SLT-Ⅱe*序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為100％。昆明鼠口服2×109CFU突變菌株O139后仍然健活，無不良反應(yīng)，說明該菌對(duì)小鼠安全。突變菌株在小鼠腸道內(nèi)定植時(shí)間檢測的結(jié)果顯

4、示，突變菌株O139可以在小鼠腸道內(nèi)至少存活3天。
　　 用突變菌株O139口服免疫Balb/c小鼠，測定各時(shí)期小鼠體重，并檢測其血清中的IgG抗體及糞便和腸黏液中的sIgA抗體水平。結(jié)果表明突變菌株O139口服免疫小鼠后不影響小鼠增重。間接ELISA方法檢測結(jié)果顯示，口服免疫組小鼠首次免疫后第7、21、28、35、42天，在其血清中檢測到抗大腸桿菌O139的O-抗原和SLT-Ⅱe B蛋白的IgG抗體（P/N>2），在首次免疫后

5、第7、14、21、28、35、42天，檢測到抗F18ab菌毛蛋白的IgG抗體（P/N>2）；在首次免疫后第35天從小鼠糞便中檢測到抗大腸桿菌O139的O-抗原的sIgA抗體（P/N>2），抗SLT-Ⅱe B蛋白和抗F18ab菌毛蛋白的sIgA抗體水平接近陽性值（P/NSLT-Ⅱe B=1.825，P/NF18ab=1.961）。第三次免疫后第14天，在小鼠腸黏液中檢測到抗大腸桿菌O139的O-抗原、SLT-Ⅱe B蛋白、F18ab菌毛蛋

6、白的相應(yīng)sIgA抗體（P/N>2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該突變菌株具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IgG和sIgA抗體。
　　 對(duì)口服免疫小鼠進(jìn)行了淋巴細(xì)胞增殖檢測及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以SLT-Ⅱe B蛋白和ConA作為抗原刺激物，檢測其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)，結(jié)果顯示口服免疫組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該突變菌株能引起小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服免疫突變菌株對(duì)小鼠能夠