農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及CBF耐逆相關(guān)基因的導(dǎo)入.pdf

1、高羊茅是目前正在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的主要冷季型草坪草之一,利用基因工程技術(shù)改良其耐逆性對保持草坪四季常綠,節(jié)約水資源,擴(kuò)大建植區(qū)域,尤其是對改善中國西部地區(qū)的生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義.該論文在對高羊茅胚性愈傷組織植株再生與農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的多種影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,將組成型表達(dá)啟動子CaMV 35S引導(dǎo)的耐逆相關(guān)CBF1基因?qū)朐摬莘N的基因組,獲得耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株.主要研究結(jié)果如下:(1)通過對成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈

2、傷組織繼代發(fā)生和分化的多種影響因素的研究,建立了高羊茅胚性愈傷組織植株再生體系.(2)以gus基因瞬時表達(dá)頻率為指標(biāo),研究確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化的適宜條件為:預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加較高濃度(0.5mg/L)的BAP和NAA,預(yù)培養(yǎng)時間3~5d;農(nóng)桿菌懸浮液OD600值0.5~0.7,感染時間10~20min;共培養(yǎng)基pH值5.2~5.6,共培養(yǎng)溫度23~25℃,共培養(yǎng)時間3d;農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)基以及共培養(yǎng)基中均添加10

3、0μ mol/L的乙酰丁香酮.(3)采用所建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系在世界上首次將耐逆相關(guān)CBF1基因?qū)?個供試高羊茅品種的基因組,經(jīng)PCR檢測、GUS組織化學(xué)染色、離體葉片潮霉素抗性鑒定和Southern雜交分析,共獲得112株獨立來源的轉(zhuǎn)基因植株,平均轉(zhuǎn)化頻率為1.7％(按GUS+愈傷組織數(shù)計算)和1.9％(按再生轉(zhuǎn)基因植株數(shù)計算),但不同品種間存在明顯差異.(4)整株存活試驗表明,在相同的高鹽與高滲脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的生長

4、優(yōu)勢,植株存活率分別達(dá)65.7％和71.4％,高于非轉(zhuǎn)化對照植株的28.6％和42.9％.經(jīng)低溫、高溫、干旱和高鹽等逆境脅迫處理后的葉片相對電導(dǎo)率測定.(5)作為該論文的相關(guān)研究內(nèi)容,從高羊茅基因組中克隆出1個608bp的CBF同源基因片段,該片段與3個擬南芥CBF基因的核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列分別具有81％~84％和75％~79％的同源性,而且推導(dǎo)氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2 DNA結(jié)合域以及為CBF蛋白獨有的兩段特征序列PK