大豆SMV誘導的EST表達譜分析及SR-EF基因研究.pdf

1、黑龍江省是我國大豆的主要產(chǎn)區(qū)，影響黑龍江省大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一就是大豆花葉病毒病。通過分子手段尋找抗大豆花葉病毒病基因及研究抗病分子機制是一種快捷而有效的抗病育種途徑。本實驗旨在利用SSH技術和RACE技術，對抗大豆花葉病毒病的大豆品種8143在抗病過程中表達譜進行分析，闡明其抗病的分子機制。并進一步尋找該品種的抗病相關基因，為功能性大豆抗病基因的克隆和利用轉基因技術提高大豆抗病性奠定基礎。主要研究結果如下：1.以抗大豆花葉病毒

2、病品種東農(nóng)8143為實驗材料，接種大豆花葉病毒1號株系后，對接種樣品和未接種樣品分別動態(tài)取樣，利用SSH技術進行消減，構建消減文庫，通過轉化計算得到質(zhì)粒文庫滴度，1/8的連接產(chǎn)物經(jīng)轉化得到了240個陽性克隆，因此本消減文庫的滴度約為2000個。2.挑取陽性克隆隨機送交測序，共對64個質(zhì)粒進行了測序。去除測序效果不好的EST序列，共獲得質(zhì)量較好的EST序列50條。測序結果顯示ESTs片段中最短的為136bp，最長的691bp，平均長度為4

3、56bp，有41條序列帶有poly(A)尾。將所獲得的50條新EST序列提交GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號如下：dbEST-ID為26613115-26613156；26613925-26613932，對應的GenBankAccn為CV997220-CV997261；CV998030-CV998037。將測序結果到GenBank進行BLASTn和BLASTx比對，其中38個有比較明確的比對結果。測序表明抗病相關的EST表達

4、譜包括的同源基因涉及19種生物，基因功能涉及大豆的細胞自身保護、信號傳導、抑制病原菌生長、系統(tǒng)獲得性抗性、以及與光合作用、呼吸作用、蛋白質(zhì)合成等相關的持家基因。功能基因不明確或新基因有12個。3.從消減文庫中獲取差異表達片段CY88，其登錄號為：dbEST-ID：26613929GenBank-Accn：CV998034。采用5′RACE技術，獲得全長cDNA基因SR-EF-1。其長度為971bp。在GenBank中注冊，登錄號為AY6

5、51886。對SR-EF-1基因進行RT-PCR分析，結果表明，SR-EF-1基因沒有接種時有輕微的表達，隨著接種時數(shù)的增加，表達逐漸增強，72h到達峰值。隨后表達呈下降趨勢，而在204h又出現(xiàn)一個小峰。因此，SR-EF-1基因是一種誘導表達型基因。Southern雜交結果發(fā)現(xiàn)，在每一組酶切中至少有2～3條條帶，表明SR-EF-1基因確為大豆基因組片段，也同時表明該基因在大豆基因組中以2個拷貝或低拷貝形式存在。4.根據(jù)全長cDNA基因設

6、計引物，擴增基因組DNA，獲得全長DNA基因G-SR-EF-1，比較可知，SR-EF-1和G-SR-EF-1基因等長，無內(nèi)含子序列。5.利用LM-PCR技術在SR-EF-1的基礎上獲得SR-EF-2基因，其長度為1559bp。通過NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的ProteinConservationDomain程序?qū)R-EF-2基因編碼的294個氨基酸進行了結構分析，結果表明，大豆SR-EF-2基因