絨毛白蠟表達(dá)譜分析及MYB基因的克隆和功能研究.pdf

1、林業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)平衡、提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)林木方面具有重要作用,而高鹽等非生物脅迫因素則嚴(yán)重制約著林木的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量。植物耐鹽性狀通常受多個(gè)基因的調(diào)控,其應(yīng)答基因涉及植物生理代謝、離子運(yùn)輸以及物質(zhì)合成等各個(gè)方面。闡明植物的耐鹽調(diào)控分子機(jī)制,對(duì)于通過(guò)基因工程手段來(lái)增強(qiáng)樹(shù)種耐鹽性具有重要的理論指導(dǎo)意義。絨毛白蠟是我國(guó)重要的林木種質(zhì)資源之一,以較強(qiáng)的耐鹽、耐旱等特性著稱,是優(yōu)良的鹽堿地造林綠化和城市園林綠化樹(shù)種。目前對(duì)于鹽脅迫下模式植物

2、的轉(zhuǎn)錄組變化等分子生物信息研究相對(duì)深入,而對(duì)木本植物這方面的研究相對(duì)較少。
　　本研究以耐鹽樹(shù)種絨毛白蠟為材料,通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Σ煌瑫r(shí)間段鹽脅迫下的絨毛白蠟幼苗進(jìn)行表達(dá)譜分析,從中獲得了大量與鹽誘導(dǎo)相關(guān)的基因,通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了8個(gè)基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式;并在此基礎(chǔ)上,克隆了2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因及其啟動(dòng)子序列進(jìn)行功能研究。結(jié)果將為深入了解絨毛白蠟?zāi)望}分子機(jī)制以及絨毛白蠟樹(shù)種遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:<

3、br>　　1.絨毛白蠟鹽脅迫下的表達(dá)譜分析
　　(1)以高鹽脅迫下的絨毛白蠟幼苗為材料,采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的6份樣品進(jìn)行序列測(cè)定,總共進(jìn)行了55,525,943次讀數(shù)。經(jīng)測(cè)序分析,在三組比較中分別得到差異表達(dá)的基因數(shù)為72、1345、1379個(gè)。其中有4個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)?個(gè)差異文庫(kù)所共有,每個(gè)差異文庫(kù)特異性表達(dá)的基因數(shù)目分別為50、317和353個(gè)。
　　(2)GO顯著性富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):NaCl脅迫0.5 h

4、后顯著上調(diào)的GOterms主要集中于氧化脅迫響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)、硝酸鹽反應(yīng)、端粒酶活性調(diào)節(jié)以及端粒酶正向調(diào)控方面。NaCl脅迫24 h后,顯著上調(diào)的GO terms數(shù)量明顯增多,除包括上述功能外,還包括脫水干旱響應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、非生物脅迫刺激響應(yīng)、ABA信號(hào)通路的調(diào)控等。Pathway顯著性富集分析共篩選出20條可能與鹽脅迫有關(guān)的代謝途徑,如植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、植物病原體互作途徑、苯丙素生物合成途徑、細(xì)胞凋亡途徑、類

5、胡蘿卜素生物合成途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)換途徑等。
　　(3)通過(guò)分析和比較NaCl脅迫不同時(shí)間點(diǎn)絨毛白蠟的基因表達(dá)譜,篩選得到許多鹽脅迫響應(yīng)基因。這些基因的功能主要涉及滲透調(diào)節(jié)與離子平衡、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面。推測(cè)這些基因很可能參與了絨毛白蠟的耐鹽脅迫過(guò)程。
　　(4)為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇了8個(gè)差異表達(dá)基因,利用實(shí)時(shí)定量qRT-PCR方法驗(yàn)證了上述基因在NaCl脅迫下的基因表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)在N

6、aCl脅迫0.5 h和24h后這些基因表達(dá)趨勢(shì)與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果一致。
　　2.絨毛白蠟MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達(dá)分析
　　(1)通過(guò)RACE手段結(jié)合表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果,首次克隆到2個(gè)絨毛白蠟MYB基因的cDNA全長(zhǎng),命名為FvMYB1和FvMYB2。其中,FvMYB1基因cDNA全長(zhǎng)為1203 bp,編碼301個(gè)氨基酸,分子量約為33.38 kDa,基因組擴(kuò)增表明該基因無(wú)內(nèi)含子;FvMYB2基因cDNA全長(zhǎng)為1201 bp,

7、編碼311個(gè)氨基酸,分子量約為35.00 kDa,基因組序列全長(zhǎng)為1476 bp,含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。
　　(2)基因組織表達(dá)模式分析結(jié)果表明:兩者在被檢測(cè)組織中均有表達(dá),其中 FvMYB1基因在莖中表達(dá)量最高,在根中表達(dá)量最低;FvMYB2基因的表達(dá)量在各組織中差異不大。對(duì)不同非生物脅迫下的基因表達(dá)模式研究表明:在NaCl、PEG和ABA處理下,FvMYB1和FvMYB2基因表達(dá)模式存在異同。其中2個(gè)基因的表達(dá)量最高值分

8、別在各處理12 h和6 h時(shí)出現(xiàn),但FvMYB1基因只對(duì)NaCl和PEG響應(yīng),而FvMYB2基因可響應(yīng)上述三種脅迫。暗示后者可能在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著更重要的作用。
　　(3)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,FvMYB1和FvMYB2基因編碼的蛋白均主要定位于細(xì)胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明,兩者均有轉(zhuǎn)錄激活活性,能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá),其中FvMYB2半乳糖苷酶活性高于FvMYB1。
　　(4)構(gòu)建了HIS-FvMYB1和

9、HIS-FvMYB2融合蛋白表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE以及Western雜交分別驗(yàn)證了2個(gè)融合蛋白的表達(dá)。從而為后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白的Western雜交提供相應(yīng)的抗體制備蛋白基礎(chǔ)。
　　(5)構(gòu)建了CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的FvMYB1、FvMYB2基因的植物過(guò)表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,對(duì)Kan篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR和Southern雜交檢測(cè)。并對(duì)正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株

10、中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析,結(jié)果表明NtP5CS、NtLEA5、NtMnSOD的表達(dá)量均高于對(duì)照。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽脅迫處理后的表型及生理生化分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草的鹽害癥狀輕于野生型煙草;且鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株在SOD、POD、CAT保護(hù)酶活性、脯氨酸含量方面均不同程度的高于野生型, MDA含量低于對(duì)照;而葉綠素含量?jī)H FvMYB2轉(zhuǎn)基因煙草高于對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FvMYB1和FvMYB2基因具有增強(qiáng)植物耐鹽性的功能

11、。
　　3.絨毛白蠟FvMYB1和FvMYB2啟動(dòng)子克隆及分析
　　(1)為進(jìn)一步鑒定該基因的功能,對(duì)FvMYB1和FvMYB2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及其表達(dá)研究。利用染色體步移法(Walking)從絨毛白蠟基因組中克隆到這兩個(gè)基因起始密碼子上游各自l140bp和1600 bp的啟動(dòng)子序列。通過(guò)PlantCARE分析FvMYB1和FvMYB2啟動(dòng)子中含有的順式作用元件,表明兩者除具有 TATA-box、CAAT-box等典型的

12、真核生物順式調(diào)控元件外,還含有大量的光反應(yīng)相關(guān)元件:G-box、GATA-motif、I-box、Box4、GAG-motif、C-box等;脅迫響應(yīng)元件:鹽誘導(dǎo)元件GT1GMSCAM4、ABA響應(yīng)元件ABRE、MBS干旱誘導(dǎo)元件、水楊酸反應(yīng)元件TCA、熱誘導(dǎo)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR等。
　　(2)為進(jìn)一步研究各順式元件的作用,將 FvMYB1和 FvMYB2啟動(dòng)子序列的不同5’端缺失片段替換植物表達(dá)載體pCAMBIA330

13、1的35S啟動(dòng)子,構(gòu)建了以GUS為報(bào)告基因的缺失表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得包含不同目的片段的轉(zhuǎn)基因煙草。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明:FvMYB1基因3個(gè)缺失片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子(242 bp、523 bp和792 bp)具有啟動(dòng)功能;FvMYB2基因中858 bp和1600 bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子可使轉(zhuǎn)基因煙草GUS染色呈藍(lán)色。且其中4個(gè)啟動(dòng)子缺失片段在鹽脅迫后 GUS染色加深,表明 FvMYB1和FvMYB2啟動(dòng)子均在一定程度上受鹽脅迫誘導(dǎo)