小麥漸滲系SR3的EST序列和表達(dá)譜分析.pdf

1、物種在進(jìn)化過程中一直伴隨著基因組序列的變異，而基因組序列的變異又是物種進(jìn)化的源動(dòng)力。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，在形成過程中因“雜合性”和“多倍性”引起的基因組沖擊使小麥基因組發(fā)生了高頻率的基因組變異，使多倍體“二倍體化”。本實(shí)驗(yàn)室利用非對(duì)稱體細(xì)胞雜交方法獲得了普通小麥(Triticum aestivum L.，2n=42)濟(jì)南177(JN177)與長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrum ponticum，2n=70)的漸滲系小麥耐鹽、抗旱和優(yōu)質(zhì)新

2、品種山融3號(hào)(SR3)。非對(duì)稱體細(xì)胞雜交過程中會(huì)發(fā)生雙親基因組短暫共存于一個(gè)細(xì)胞核、供體染色質(zhì)大規(guī)模消減和少量供體染色質(zhì)漸滲到受體基因組等事件，因而是一種特殊的二倍體化，也能引起強(qiáng)烈的基因組沖擊，并產(chǎn)生系統(tǒng)性的基因組變異。但至今非對(duì)稱雜交介導(dǎo)的基因組變異特征和機(jī)制及其和異源多倍體化的差異還未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)室分子標(biāo)記和功能基因分析顯示，SR3基因組發(fā)生了遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變異，但變異程度和特征仍不清楚。本試驗(yàn)擬構(gòu)建SR3和

3、親本小麥JN177的cDNA文庫(kù)并進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，通過EST功能注釋、EST序列分析和cDNA芯片雜交，從組學(xué)水平系統(tǒng)分析非對(duì)稱體細(xì)胞雜交對(duì)SR3基因組的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的影響及其與SR3耐鹽能力的關(guān)系，為闡明非對(duì)稱雜交介導(dǎo)的基因組變異機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
　　 一、SR3和JN177 cDNA文庫(kù)構(gòu)建
　　 現(xiàn)在常用的文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)課題研究目標(biāo)，本試驗(yàn)利用Stratagene技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)噬菌體文

4、庫(kù)：SR3鹽脅迫根葉混合文庫(kù)和SR3旱脅迫根葉混合文庫(kù)；利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)重組文庫(kù)：SR3鹽旱脅迫根混合文庫(kù)和JN177鹽旱脅追根混合文庫(kù)。四個(gè)cDNA文庫(kù)容量均達(dá)到107以上，插入片段的平均長(zhǎng)度超過1.3kb，滿足大規(guī)模測(cè)序的需要，為系統(tǒng)分析非對(duì)稱雜交介導(dǎo)的基因組變異和深入開展小麥功能基因?qū)W研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 二、SR3和JN177 cDNA文庫(kù)的大規(guī)模測(cè)序和注釋
　　 利用5’端測(cè)序方法，獲得

5、了18192條SR3和9770條JN177的高質(zhì)量5’端EST序列，總長(zhǎng)度分別達(dá)到11678320 bp和7131983 bp。經(jīng)CAP3軟件聚類分析，分別獲得了9634和7107條不重復(fù)的單一EST序列，其中contigs分別為2097和1207條，sigletons分別為7537和5900條，全長(zhǎng)序列分別為4825條和2975條。利用本地BLAST軟件將這些單一EST序列和小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)沒有比對(duì)結(jié)果的476條SR3序

6、列和594條JN177序列是新的小麥EST，而且部分SR3序列可能是來源于長(zhǎng)穗偃麥草的外源序列。利用Blast2GO工具獲得的單一EST序列進(jìn)行功能注釋和分類，發(fā)現(xiàn)在SR3 cDNA文庫(kù)中含有高豐度的抗逆和抗病相關(guān)EST。利用codonw軟件對(duì)SR3和JN177的密碼子使用偏愛性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明SR3和JN177 EST密碼子第三位GC含量分別為67.4％和69.7％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小麥基因整體序列的GC含量，而且SR3整體序列的GC含量

7、明顯低于JN177。
　　 三、SR3和JN177的EST序列多態(tài)性分析
　　 為了系統(tǒng)分析小麥品種間序列多態(tài)性和非對(duì)稱雜交介導(dǎo)的序列多態(tài)性，本試驗(yàn)進(jìn)行了三組比對(duì)分析：JN177 EST序列比對(duì)小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)(JN177-Ta)、SR3EST序列比對(duì)小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)(SR3-Ta)和SR3 EST序列比對(duì)JN177 EST序列(SR3-JN177)。然后從中提取相似性大于等于96％的序列進(jìn)行多態(tài)性分析，其中SR3-JN

8、177有2581條，SR3-Ta有7284條，JN177-Ta有5072條。
　　 與Ta數(shù)據(jù)庫(kù)相比，JN177 EST序列的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)和1-22核苷酸插入/缺失(Insertion and Deletion，InDel)頻率分別為9.02 SNPs/kb EST和3.81 InDels/kb EST，SR3 EST序列的SNPs和InDels頻率分別為9

9、.09 SNPs/kb EST和4.29 InDels/kb EST；而與JN177相比，SR3 EST序列的SNPs和InDels頻率較高，分別為11.8 SNPs/kb EST和5.44 InDels/kb EST。這些結(jié)果表明非對(duì)稱體細(xì)胞雜交可以引起高頻率的基因組變異；SR3-Ta間的基因組多態(tài)性并非是非對(duì)稱體細(xì)胞雜交過程新產(chǎn)生的多態(tài)性和JN177-Ta間原有多態(tài)性的簡(jiǎn)單疊加，暗示基因組變異可能存在可逆的恢復(fù)變異機(jī)制，而且SNPs

10、的恢復(fù)能力更強(qiáng)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型SNP和InDel的發(fā)生頻率具有不均衡的特點(diǎn)。與JN177-Ta和SR3-Ta相比，SR3-JN177中A→T和T→A在總SNPs中所占比例明顯降低，而C→T所占比例則顯著提高(16.6％：14.8％)。C→T的堿基替換主要通過甲基化C脫氨實(shí)現(xiàn)，顯示非對(duì)稱體細(xì)胞雜交顯著改變了SR3基因組的甲基化水平。SR3-Ta和JN177-Ta之間不同類型SNP所占比例也不相同，其中G→A頻率在SR3

11、-Ta SNPs中占17％，而在JN177-Ta只占14％，表明不同SNP的可逆性存在差異。SR3-JN177中單核苷酸Insertion頻率占單核苷酸InDel的62.0％，JN177-Ta中占74.6％，而SR3-Ta中占76.4％，表明Insertion和Deletion的不均衡性導(dǎo)致InDel的可逆性程度較低，而且非對(duì)稱體細(xì)胞雜交介導(dǎo)的Insertion和Deletion頻率的均衡性高于自然和異源多倍體進(jìn)化。JN177-Ta和S

12、R3-Ta中大片段(>22bp)Deletion頻率高于Insertion頻率，表明異源六倍體小麥中的二倍體化是一直發(fā)生著的進(jìn)化事件。但SR3-JN177中大片段Insertion頻率高于Deletion頻率，暗示非對(duì)稱體細(xì)胞雜交雜種和異源多倍體中“二倍化”的機(jī)制存在顯著差異。
　　 分析顯示，InDel相鄰核苷酸的GC含量具有特異性。JN177-Ta和SR3-Ta中Insertion左邊相鄰核苷酸GC含量很高而右邊相鄰核苷酸G

13、C含量很低，Deletion正好相反；在SR3-JN177中Insertion和Deletion均為左邊相鄰核苷酸GC含量較高，而右邊相鄰核苷酸GC含量較低。這說明InDel不是一種隨機(jī)的生物學(xué)事件，GC含量可能是InDel位點(diǎn)的識(shí)別特征，而且非對(duì)稱體細(xì)胞雜交雜種和異源多倍體中的識(shí)別機(jī)制存在差異。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)6-22nt InDel具有“3N”特征，即6、9、12、15、18和21nt InDel頻率及其側(cè)翼序列GC含量均高于相鄰

14、大小InDel，而且InDel頻率與側(cè)翼序列GC含量存在指數(shù)相關(guān)性，其中SR3-JN177中相關(guān)性最高。
　　 此外，SR3-JN177中有些InDel兩端具有重復(fù)序列的拷貝或者存在滑動(dòng)現(xiàn)象，而且有些序列存在轉(zhuǎn)位和反向重復(fù)等特征，表明非對(duì)稱體細(xì)胞雜交能夠引起多樣化的基因組變異。
　　 四、SR3和JN177的cDNA芯片分析
　　 為了評(píng)估高頻率的基因組變異對(duì)轉(zhuǎn)錄組的影響以及SR3的耐逆分子基礎(chǔ)，我們利用cDNA

15、芯片比較了對(duì)照和鹽、旱脅迫下SR3和JN177幼苗根轉(zhuǎn)錄組差異。為了涵蓋部分漸滲到SR3中的長(zhǎng)穗偃麥草序列，本試驗(yàn)根據(jù)部分cDNA文庫(kù)序列和功能數(shù)據(jù)庫(kù)小麥EST拼接序列設(shè)計(jì)探針，點(diǎn)制了60-mer cDNA芯片，其包含15172個(gè)探針，代表小麥15000個(gè)unigene。
　　 對(duì)照條件下，共有508個(gè)探針的轉(zhuǎn)錄水平在SR3和JN177間存在顯著差異，其中在SR3中高表達(dá)的探針有241個(gè)，低表達(dá)的探針有267個(gè)。高表達(dá)探針中脅迫

16、響應(yīng)過程的富集程度最高，包括冷調(diào)節(jié)蛋白、熱激蛋白和脫水素等。此外，戊糖磷酸和抗壞血酸鹽代謝以及一些茉莉酸和赤霉素合成和響應(yīng)途徑基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，而碳和能量代謝相關(guān)基因表達(dá)降低。
　　 NaCl處理0.5h后，SR3和JN177中上調(diào)表達(dá)的探針分別有122和87個(gè)，其中48個(gè)共同上調(diào)；下調(diào)表達(dá)的探針分別為101和218個(gè)，其中75個(gè)共同下調(diào)。PEG處理0.5h后，SR3和JN177中上調(diào)表達(dá)的探針分別為215和210個(gè)，下調(diào)表達(dá)的

17、探針分別為81和143個(gè)，其中同時(shí)上調(diào)和下調(diào)的探針分別為71和29個(gè)。NaCl處理24h后，SR3和JN177上調(diào)表達(dá)的探針分別為1451和1556個(gè)，下調(diào)表達(dá)的探針分別為1579和1507個(gè)，其中同時(shí)上調(diào)和下調(diào)的探針分別為950和978個(gè)。有趣的是，除了4個(gè)探針外，其他非共同響應(yīng)的探針均表現(xiàn)出品種特異性的脅迫響應(yīng)特征，即在脅迫條件下只在一個(gè)品種中表達(dá)發(fā)生變化，而在另一個(gè)品種中表達(dá)量保持不變。生物途徑聚類分析顯示，PEG和NaCl脅迫0

18、.5h后，SR3中非飽和脂肪酸和脂肪生物合成即α-亞麻酸代謝耐逆相關(guān)過程的活性顯著高于JN177；NaCl處理24h后，抗壞血酸代謝、糖酵解/糖異生、不飽和脂肪酸和類黃酮生物合成等耐逆相關(guān)過程在SR3中被顯著促進(jìn)。這些途徑增強(qiáng)與G蛋白-磷脂-ABA/DREB信號(hào)通路活性以及激素合成和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的整體提升相關(guān)。
　　 將SR3與JN177 EST序列與芯片探針序列進(jìn)行比對(duì)，具有匹配探針的EST序列分別有3471和1618條，但這些序

19、列豐度與匹配探針的雜交信號(hào)間沒有相關(guān)性。為了比較序列變異對(duì)基因表達(dá)的影響，我們從這些序列中提取出SR3和JN177同源且匹配探針表達(dá)變化的序列61條。上調(diào)表達(dá)探針匹配的序列共有17條，均具有SNPs，其中15條含有InDel，包括一個(gè)414bp的大片段InDel。下調(diào)表達(dá)探針匹配的序列有42條，其中39條具有SNPs，27條含有InDel。
　　 根據(jù)EST多態(tài)性分析和探針功能注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SR3和JN177間基因表達(dá)差異是以下

20、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)因素系統(tǒng)改變的結(jié)果：1、序列發(fā)生了高頻率的SNP和InDel變異；2、來源于供體親本長(zhǎng)穗偃麥草的漸滲序列；3、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的改變；4、一系列組蛋白變體和組蛋白修飾相關(guān)基因表達(dá)模式的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致染色體重塑；5、DNA甲基化模式的改變。
　　 綜上，通過對(duì)SR3和JN177 cDNA文庫(kù)的高通量測(cè)序、序列比較和cDNA芯片分析表明，非對(duì)稱體細(xì)胞雜交過程中基因組發(fā)生了有規(guī)律的高頻率序列變異和表達(dá)變異，從而