小麥漸滲系山融3號MYB基因家族對非生物脅迫的響應(yīng)及Tamyb31基因功能研究.pdf

1、小麥的耐逆性是由多基因控制的復(fù)雜形狀，耐逆性的提高需要脅迫應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、次生代謝以及能量代謝等多方面因素。目前分子生物學(xué)研究及應(yīng)用已經(jīng)顯著提高了水稻、玉米等對不良環(huán)境的抵抗性，但在小麥中，這種進(jìn)展相對比較緩慢。因此有必要加強(qiáng)加深對小麥逆境下分子機(jī)理的研究，而現(xiàn)階段主要的方式是從轉(zhuǎn)錄組變化中找出候選基因，進(jìn)而驗(yàn)證基因在抗逆中的功能，已經(jīng)有一些成功的報(bào)道。但對于普通小麥這樣一個(gè)異源六倍體來講，對其耐逆基因的報(bào)道很少，對其整個(gè)耐逆響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)還

2、缺乏研究。
　　 小麥漸滲系山融3號(SR3)，是普通小麥濟(jì)南177(Triticum aestivum L.2n=42)同耐鹽小麥近緣屬長穗偃麥草(Ae)(Thinopyrum ponticum2n=70)不對稱體細(xì)胞融合后代。SR3耐逆性高于JN177，特別是在鹽/旱脅迫下。SR3同JN177的對比研究，提供了一個(gè)很好的研究小麥耐逆機(jī)制的平臺。早期的研究表明，SR3基因組中漸滲了Ae的基因組序列，其抗逆性是由一個(gè)主效基因位點(diǎn)

3、和多個(gè)微效基因控制。但具體到哪些基因在起作用，還不是很清楚。
　　 在實(shí)驗(yàn)室前期對SR3重要耐逆相關(guān)基因TaCHP和TaCEO的功能研究中，發(fā)現(xiàn)它們在過表達(dá)擬南芥中增加抗逆性的同時(shí)，都影響AtMYB15的表達(dá)。而在擬南芥中，MYB家族是最大的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族；其中一些MYB基因可以顯著提高擬南芥抗逆性。類似的在水稻和玉米中，一些MYB基因參與到抗逆響應(yīng)中。而對小麥MYB家族在抗逆性中作用的研究還沒有報(bào)道。本論文通過分析SR3芯片

4、數(shù)據(jù)，整理出了38個(gè)響應(yīng)脅迫的MYB基因(Unigene/EST)。通過RT-PCR分析，系統(tǒng)研究了小麥漸滲系MYB基因?qū)}/旱脅迫的響應(yīng)，揭示MYB基因參與耐逆調(diào)控的可能方式，并分析了MYB基因發(fā)育周期中的表達(dá)模式；對JN177/SR3間MYB基因等位變異進(jìn)行了分析，進(jìn)一步闡明MYB參與脅迫的方式及內(nèi)容；選擇了其中一個(gè)在JN177與SR3的具有序列差異的Tamyb31基因，進(jìn)行功能鑒定。
　　 主要的研究內(nèi)容及結(jié)果包括：

5、>　　 1.MYB基因信息的整理在實(shí)驗(yàn)室芯片數(shù)據(jù)中，通過探針序列的BlastN分析，得到了SR3和JN177三葉期表達(dá)的36個(gè)MYB基因?qū)?yīng)的Unigene(EST)信息。由于MYB家族在水稻和擬南芥中較為龐大，分析的這36個(gè)MYB基因只是小麥MYB基因家族的一部分。為此，又進(jìn)一步從山融3號cDNA文庫中克隆到了另外兩個(gè)MYB基因，加起來總共有38個(gè)基因。
　　 2.MYB基因?qū)}/旱脅迫的響應(yīng)分析及發(fā)育周期表達(dá)模式分析通過R

6、T-PCR方法研究了SR3及JN177在鹽/旱脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的差異，驗(yàn)證了芯片結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)間，35個(gè)MYB基因響應(yīng)鹽/旱脅迫一共存在42種表達(dá)模式(另外3個(gè)MYB低于RT-PCR的檢測限)。
　　 不同MYB基因在同樣的處理下，有著不同的響應(yīng)模式，例如鹽處理SR3葉中MYB3/17呈L1型表達(dá)模式，快速響應(yīng)鹽脅迫處理，在0.5h達(dá)到峰值，之后持續(xù)降低表達(dá)量；而MYB1/819/11/15/16/19/27/31/

7、33則呈L6型表達(dá)模式，即呈現(xiàn)波浪形表達(dá)模式，在0.5/6h到峰值。這表明在同樣的器官同樣的品種同樣的處理下，各個(gè)MYB之間對脅迫信號的響應(yīng)不同，這可能與MYB基因的功能差異有關(guān)。
　　 同一MYB基因在不同脅迫下的響應(yīng)模式不一致，例如SR3葉中，MYB31在鹽/旱脅迫下表達(dá)模式分別為L6/L41型。L6型呈現(xiàn)波浪形變化；L41型呈現(xiàn)一種逐步下降的情況，在0.5h升至最高，之后表達(dá)逐漸下降，在12h略有回升，之后接著下降。這表明

8、MYB31在鹽/旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的位置不同，也就是體現(xiàn)了鹽/旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異。
　　 同一MYB基因在不同的器官中表達(dá)模式不一致，例如鹽處理下SR3中的MYB4，在葉/根中分別呈L11/L16型表達(dá)模式，L11型在3h有個(gè)表達(dá)高峰，而在其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化不明顯；L16型則是從開始處理后就呈現(xiàn)下降趨勢。這體現(xiàn)了鹽脅迫下，根和葉的同一MYB基因?qū)γ{迫的響應(yīng)不同。
　　 同一MYB基因在SR3和JN177中間的表達(dá)模式也

9、不一致，在鹽處理下的根中，MYB3分別呈L15/L7型表達(dá)模式。L15型是Oh之后表達(dá)量就開始下降，L7型則是呈波浪型變化。這種差異體現(xiàn)了不同品種對脅迫響應(yīng)的差異，可能是造成對脅迫抗性差異的原因。
　　 也有少數(shù)幾個(gè)MYB基因在特定情況下存在一致的表達(dá)模式，例如鹽處理下的葉中，SR3和JN177中的MYB29都呈L7型表達(dá)模式；鹽處理下濟(jì)南177中的MYB15，在根和葉中都呈現(xiàn)出L6型表達(dá)模式；JN177根中的MYB13在鹽旱脅

10、迫下表達(dá)模式都呈現(xiàn)出L7型。整體上看，MYB基因?qū)γ{迫的響應(yīng)比較復(fù)雜。
　　 如何去判斷哪些MYB基因及其表達(dá)模式同SR3/JN177抗逆性差異相關(guān)。我們從兩方面入手：第一方面，找出SR3/JN177各自特異的表達(dá)模式。在42種表達(dá)模式中，SR3/JN177間差異的表達(dá)模式有13種。SR3中特異的響應(yīng)模式有L3/L11/12/13/20/23/37/38型，而JN177中特異的有L28/29/30/34/35/36型。這些差異對

11、我們選擇候選基因提供了線索；第二個(gè)方面我們選擇單個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行功能研究，例如，我們鑒定了MYB31對應(yīng)基因的功能，而其脅迫響應(yīng)的模式有L6/L7/L17/L18/L26/L41型，這些類型對應(yīng)的基因是我們進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。
　　 由于芯片取材選擇了小麥的三葉期；為避免發(fā)育時(shí)期的限制，進(jìn)一步比較了SR3不同發(fā)育時(shí)期MYB基因的表達(dá)譜。以上發(fā)現(xiàn)有助于提供候選MYR基因用于功能驗(yàn)證，并在育種中加以應(yīng)用。
　　 3.MYB基因結(jié)

12、構(gòu)分析由于小麥含有A，B，D三個(gè)基因組，而SR3又是體細(xì)胞雜種后代，每個(gè)MYB基因在SR3中的拷貝數(shù)不清楚；參與脅迫響應(yīng)的MYB，是不是其RT-PCR產(chǎn)物就僅對應(yīng)一個(gè)轉(zhuǎn)錄本?而轉(zhuǎn)錄本的差異也會對SR3和濟(jì)南177抗逆性差異產(chǎn)生影響，特別是當(dāng)RT結(jié)果顯示為同一表達(dá)模式時(shí)。為此我們將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，同時(shí)又對對應(yīng)的基因組序列進(jìn)行了比較。
　　 在分析的15個(gè)MYB基因中，RT產(chǎn)物中僅有MYB5/22是一個(gè)轉(zhuǎn)錄本；而其余13個(gè)

13、MYB基因，則有多余一個(gè)的轉(zhuǎn)錄本。這些轉(zhuǎn)錄本在JN177和SR3中普遍存在差異，可能是JN177和SR3抗逆性差異的原因之一。具體細(xì)化分析時(shí)，用等位變異來描述這些差異；我們發(fā)現(xiàn)這些差異主要是SNP差異，多數(shù)是Substitution，Indel位點(diǎn)僅存在兩處。在同一個(gè)MYB基因中，不同等位基因位點(diǎn)發(fā)生的變化不同，例如在MYB5的兩個(gè)等位位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)都存在G/A的SNP多態(tài)性，但存在的位置不同。不同的MYB基因，等位變化也往往不同，例如

14、MYB19中，三個(gè)等位基因位點(diǎn)都發(fā)生了變化；而對MYB18來講，兩個(gè)等位基因位點(diǎn)上都沒有發(fā)生序列上的變化。內(nèi)含子中SNP-Indel的頻率要高于外顯子中的頻率，而SNP-Substitution的頻率在內(nèi)含子中要低于外顯子中的頻率。在MYB9/22中，啟動子的核苷酸多態(tài)性要大于基因編碼區(qū)域的核苷酸多態(tài)性。SNP中的核苷酸轉(zhuǎn)化方式以轉(zhuǎn)換為主。
　　 通過分析，同時(shí)發(fā)現(xiàn)等位基因上的SNP可以使編碼的氨基酸發(fā)生變化。我們認(rèn)為在小麥抗逆

15、研究中，除了要關(guān)注MYB基因表達(dá)模式變化，還要關(guān)注同樣表達(dá)模式下哪些MYB轉(zhuǎn)錄本在其中起作用。
　　 4.Tamyb31功能研究在以上小麥MYB基因家族中，SR3的MYB31隨脅迫上調(diào)表達(dá)，并且上調(diào)比較明顯。從cDNA文庫中分離得到了其全長，通過同源比對，SR3與JN177中的MYB31存在SNP-Substitution，并且導(dǎo)致其蛋白質(zhì)氨基酸的變異，將其命名為Tamyb31。Tamyb31 cDNA由192bp的5'UTR，

16、765bp的開放閱讀框(ORF)以及298bp的3'UTR構(gòu)成。通過體外DNA結(jié)合試驗(yàn)以及轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)，證實(shí)了Tamyb31是起作用的轉(zhuǎn)錄本。通過設(shè)計(jì)特異的引物研究其脅迫響應(yīng)模式，在山融3號的根中，其表達(dá)模式類似MYB31的情況，但在葉中不同于MYB31的表達(dá)模式。在鹽旱處理下，Tamyb31都是在0.5h就明顯上調(diào)表達(dá)，這表明Tamyb31參與早期鹽旱脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在激素處理下，Tamyb31在0.5h瞬時(shí)上調(diào)表達(dá)，表明Tamyb3

17、1參與多種激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。從發(fā)育時(shí)期來講，Tamyb31在整個(gè)發(fā)育期中都有表達(dá)，而在拔節(jié)期中的莖中表達(dá)量最高。Tamyb31編碼一個(gè)R2R3型MYB蛋白；同其它物種中的MYB蛋白相比，其SANTdomain的保守性很高；亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核內(nèi)；結(jié)合Ⅰ/Ⅱ/ⅡG型MYB結(jié)合基序。
　　 Tamyb31的擬南芥過表達(dá)系明顯增加了對鹽/旱脅迫的抗性。在NaCl處理下，過表達(dá)系的根長明顯長于對照的根長；同時(shí)過表達(dá)系增加了對LiCl/KCl

18、的抗性。這表明Tamyb31可能增加對離子脅迫的抗性。在甘露醇處理下，過表達(dá)系同對照系的表型沒有明顯差異。在控水干旱處理時(shí)，過表達(dá)系存活率要高于對照系；這可能同過表達(dá)系較低的失水率有關(guān)。Tamyb31也增加了過表達(dá)系萌發(fā)時(shí)對NaCl和ABA的抗性。NaCl處理下，過表達(dá)系中AtP5CS1/CBF3基因的表達(dá)量高于對照；不處理情況下，AtABF3的表達(dá)量在過表達(dá)系中較高。Tamyb31可能通過調(diào)控這些基因的變化來提高擬南芥的抗性。同時(shí)我們

19、又分析了AtCBF3/ABF3的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)兩者啟動子上有多個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Tamyb31可以結(jié)合這些啟動子區(qū)域。
　　 Tamyb31與AtMYB15有很高的同源性，但兩者在功能上有所差異。例如AtMYB15可以同AtICE1相互作用，而Tamyb31則不可；Tamyb31沒有選擇性的結(jié)合Ⅰ/Ⅱ/ⅡG型結(jié)合基序，而AtMYB15則優(yōu)先結(jié)合Ⅱ/ⅡG基序。這表明兩者之間在脅迫中的作用有所差異。
　　 通