小麥漸滲系新品種山融3號(hào)耐鹽表達(dá)譜和耐鹽相關(guān)基因研究.pdf

1、植物的耐鹽性是由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因涉及到代謝、細(xì)胞防御、能量、離子平衡和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等諸多方面，所有這些基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，對(duì)鹽漬脅迫下植物基因表達(dá)整體概況的研究有助于我們更好的理解植物的耐鹽機(jī)制。 耐鹽小麥品種山融3號(hào)是小麥品種濟(jì)南177(Triticum aestivum L. 2n=42)與其小麥族偃麥草屬禾草長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrum ponticum 2n=70

2、)經(jīng)過(guò)不對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的體細(xì)胞雜種漸滲系。遺傳及生理生化的分析表明，該品種含有長(zhǎng)穗偃麥草染色體小片段，耐鹽指數(shù)及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均其耐鹽性明顯優(yōu)于親本小麥。山融3號(hào)不同于其它耐鹽相關(guān)研究所利用的單一遺傳背景的材料，其耐鹽性由主效基因和微效基因共同控制。 本文利用小麥全基因組芯片，研究了山融3號(hào)及其親本濟(jì)南177經(jīng)不同時(shí)間鹽脅迫后不同組織的誘導(dǎo)表達(dá)譜，從轉(zhuǎn)錄組的水平對(duì)小麥鹽脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，并從山融3中克隆了3

3、個(gè)耐鹽相關(guān)基因，進(jìn)行了功能研究，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括： 1.利用Affymetrix 小麥基因芯片分析小麥鹽脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜采用Affymetrix小麥全基因組芯片(GeneChip Wheat Genome Array)，首次構(gòu)建了小麥體細(xì)胞雜交耐鹽品種山融3號(hào)及其親本濟(jì)南177鹽脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)譜，一共獲得6504個(gè)差異表達(dá)探針，代表了5,577個(gè)鹽脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因。主要參與主要包括脅迫響應(yīng)、鈣離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、

4、氮代謝、氨基酸代謝以及氧化還原等過(guò)程。在鹽脅迫下根系中的差異表達(dá)基因比葉片中的大約多一倍，由于根系直接面對(duì)鹽脅迫，所以其差異表達(dá)基因多與離子吸收有關(guān)，主要包括許多水通道蛋白、鈣依賴的鉀離子通道以及一些非選擇性通道蛋白等。對(duì)鹽脅迫特異性誘導(dǎo)或者抑制表達(dá)探針的分析表明液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Na+/H+ antiporter(NHX1)、液泡膜焦磷酸酶基因PPase和TaHKT1在山融3號(hào)和濟(jì)南177中差異表達(dá)，揭示離子吸收和區(qū)隔化的調(diào)控

5、可能在山融3號(hào)的耐鹽中起了重要作用。部分重要鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在山融3號(hào)和濟(jì)南177之間也存在差異表達(dá)，ABA合成途徑相關(guān)基因以及ABA響應(yīng)的因子，JA以及GA信號(hào)途徑的有關(guān)基因在鹽脅迫后均上調(diào)表達(dá)，表明在小麥中激素途徑與逆境響應(yīng)途徑也有交叉。組蛋白可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾來(lái)誘導(dǎo)或者抑制許多功能基因的表達(dá)，它們?cè)邴}脅迫后的大量下調(diào)表達(dá)暗示其在山融3號(hào)的鹽脅迫應(yīng)答中起作用，值得我們進(jìn)一步研究。 2.小麥耐鹽相關(guān)基因TaCHP的全長(zhǎng)cDNA克隆及

6、初步的功能分析對(duì)一個(gè)功能未知的鋅指蛋白基因TaCHP進(jìn)行了克隆和測(cè)序，表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后TaCHP在根系中特異性表達(dá)，而且在山融3號(hào)和濟(jì)南177間有明顯的差異表達(dá)。TaCHP表達(dá)不受干旱脅迫、氧化脅迫的影響，而ABA脅迫后其表達(dá)譜與鹽脅迫的表達(dá)一致，推測(cè)TaCHP基因在山融3號(hào)的表達(dá)與滲透脅迫和氧化脅迫無(wú)關(guān)，可能是鹽脅迫和ABA響應(yīng)途徑共同的調(diào)控因子。組織原位雜交結(jié)果表明TaCHP在山融3號(hào)根系成熟區(qū)的皮層細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞中都有表達(dá)，

7、說(shuō)明TaCHP基因參與了山融3號(hào)的鹽脅迫過(guò)程。 TaCHP的蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)TaCHP的氨基酸序列包含三個(gè)植物特有的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域-DC1 domain，推測(cè)其可能參與了植物磷酸肌醇參與逆境脅迫的響應(yīng)途徑。擬南芥中過(guò)量表達(dá)TaCHP基因后，轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性生長(zhǎng)明顯好于對(duì)照，說(shuō)明外源基因的插入和過(guò)量表達(dá)可能提高了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)于Na+的耐受性。 3.小麥中耐鹽相關(guān)的蛋白酶抑制劑基因TaWRSI5的分析從山融3號(hào)和其親本中克

8、隆了TaWSRI5基因。該基因在DDRT和基因芯片檢測(cè)中都受到鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。TaWSRI5編碼一個(gè)小麥中的BBI型蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk type Protease Inhibitor)，具有胰蛋白酶抑制活性。表達(dá)譜分析表明TaWRSI5基因在H2O2脅迫后1小時(shí)即被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，而在鹽處理后大約6小時(shí)，鋁脅迫和干旱脅迫后大約24小時(shí)，TaWRSI5基因的表達(dá)才到達(dá)峰值，所以推測(cè)TaWRSI5基因的表達(dá)受到H2O2的調(diào)控

9、，可能參與了多種脅迫響應(yīng)途徑。TaWRSI5的組織原位雜交發(fā)現(xiàn)其在山融3號(hào)根尖成熟區(qū)的內(nèi)皮層細(xì)胞中特異表達(dá)，而在濟(jì)南177的相同位置上沒(méi)有檢測(cè)到明顯的雜交信號(hào)，過(guò)表達(dá)TaWRSI5基因的擬南芥株系也可以在一定程度上提高轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性。揭示TaWRSI5基因可能通過(guò)參與調(diào)控Na+的運(yùn)輸或者調(diào)節(jié)Na+在植物體內(nèi)的分布來(lái)提高植物的耐鹽性。 小麥耐鹽相關(guān)基因TaSKC1的克隆及初步功能分析小麥耐鹽的一個(gè)重要機(jī)制是調(diào)節(jié)離子的吸收，運(yùn)輸

10、從而維持植物體內(nèi)較低的Na+濃度。利用RACE技術(shù)分別從山融3號(hào)，濟(jì)南177中克隆了小麥中的同源基因TaSKC1，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明TaSKC1的氨基酸序列與OsSKC1和AtHKT1的同源性最高，推測(cè)其可能參與Na+通過(guò)韌皮部汁液從地上部分至根部的再循環(huán)過(guò)程，從而減少葉片中Na+的積累。酵母突變體功能互補(bǔ)試驗(yàn)揭示TaSKC1能夠介導(dǎo)鹽脅迫后Na+的吸收，過(guò)表達(dá)TaSKC1的酵母細(xì)胞對(duì)Na+更敏感。推測(cè)鹽脅迫后TaSKC1的表達(dá)量降低可能

11、是離子脅迫反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果，鹽脅迫下植物中由于積累過(guò)多的Na+，使細(xì)胞受到鹽害，激活大量鹽脅迫響應(yīng)因子，通過(guò)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，反饋抑制TaSKCl的表達(dá)，從而降低Na+進(jìn)入植物體或者向地上部位運(yùn)輸?shù)乃俾?，維持植物細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。 4.小麥體細(xì)胞雜交與基因突變和基因表達(dá)差異TaSKC1和TaCHP基因的序列比較分析表明其是來(lái)自其小麥親本濟(jì)南177，而且在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，所以他們?cè)邴}脅迫下山融3號(hào)和濟(jì)南177間的差異表達(dá)很

12、可能取決于上游調(diào)控序列的不同。對(duì)TaWSRI5基因序列的分析顯示：山融3號(hào)中TaWSRI5基因可能來(lái)自長(zhǎng)穗偃麥草與濟(jì)南177中的同源基因重組，另外有少數(shù)堿基發(fā)生了點(diǎn)突變。研究結(jié)果從分子水平上驗(yàn)證了體細(xì)胞雜交可以導(dǎo)致受體的基因組的劇烈變化，不僅可引起受體功能基因的結(jié)構(gòu)變化，而且還導(dǎo)致其表達(dá)水平的變化，這種的變化可促進(jìn)新基因、新性狀的形成和小麥種質(zhì)創(chuàng)新。 總之，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)山融3號(hào)和濟(jì)南177的研究發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞雜交導(dǎo)致了二者基因組中