山融3號小麥耐鹽相關(guān)過氧化物酶基因及植物抗砷基因工程初步研究.pdf

1、土壤鹽漬化是世界范圍內(nèi)影響糧食產(chǎn)量的重要原因，在目前糧食緊缺、人口不斷增長、生存環(huán)境日益惡化的嚴(yán)峻形勢下，提高禾谷類植物抗逆性研究顯得尤為重要。過氧化物酶（POD）是植物在逆境條件酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一。對POD功能進(jìn)行研究，對耐鹽優(yōu)良小麥品種的培育具有十分重要的意義。 在前期實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室利用RACE技術(shù)，從山融3號（SR3）小麥中克隆了過氧化物酶基因TaPOD，并對其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)利用35S1301/TαPO

2、D重組載體進(jìn)行了pod缺陷型擬南芥的轉(zhuǎn)化；在擬南芥原生質(zhì)體和洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)中，進(jìn)行了TaPOD的亞細(xì)胞定位，將TaPOD定位于細(xì)胞質(zhì)或其質(zhì)膜上。對轉(zhuǎn)TαPOD基因T1代植株進(jìn)行了PCR驗(yàn)證、鹽處理后形態(tài)觀察、POD酶活性分析，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶相關(guān)基因的過量表達(dá)和過氧化物酶活性的提高與植物耐逆性相對應(yīng)；利用TαPOD特異性引物對該基因在高冰草、SR3及濟(jì)麥177（JN177）基因組中進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序，相似性分析表明TαPOD

3、在SR3及JN177一致，TαPOD基因來自親本JN177。它與高冰草中的POD基因相似性達(dá)92．5％。運(yùn)用分析軟件分別對SR3，高冰草中POD的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者主要差別在內(nèi)含子區(qū)；利用TαPOD特異引物對中國春缺體系DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，初步將TαPOD基因定位在小麥7B染色體上，實(shí)驗(yàn)室已完成的TαPOD的Southern雜交結(jié)果中發(fā)現(xiàn)TαPOD以多拷貝的形式存在，據(jù)此推測該基因可能以多拷貝的形式存在于同一染色體上。利用本

4、實(shí)驗(yàn)室雙向電泳信息設(shè)計(jì)引物，從SR3小麥中擴(kuò)增出TαPOX9、TαSOD片段；BLAST信息顯示這兩個(gè)片段分別與一粒小麥中的peroxidase9基因相似性達(dá)到99％，與普通小麥中的SOD3．1相似性達(dá)到99％；利用RT-PCR分析了鹽脅迫下TαPOX9和TαSOD基因片段在不同組織、不同時(shí)間的表達(dá)模式：在鹽處理后TαPOX9表達(dá)量無明顯差別，而TαSOD在根部無明顯差別，在葉中表達(dá)量先上調(diào)再下降。推測TαPOX9在SR3號中為組成型表

5、達(dá)，而TαSOD得表達(dá)受組織特異性的啟動(dòng)子及逆境的調(diào)控，在根部為組成型表達(dá)，在葉中鹽脅迫的初期上調(diào)表達(dá)以消除鹽害的影響。 本論文利用PCR法，獲得了來源于原核生物抗砷相關(guān)基因αrsBC，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體pROK2/arsBC；通過花浸染法轉(zhuǎn)化了野生型擬南芥，經(jīng)PCR驗(yàn)證、抗生素篩選等，證明arsBC基因已經(jīng)整合進(jìn)擬南芥基因組并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。論文統(tǒng)計(jì)了轉(zhuǎn)基因擬南芥T2，T3代的分離比，并得到了純合的轉(zhuǎn)基因株系，對其進(jìn)行了