黃瓜-酸黃瓜漸滲系抗霜霉病相關基因的分離、進化及表達分析.pdf

1、黃瓜是世界范圍內的一種重要蔬菜。近年來,隨著設施栽培面積的不斷擴大,黃瓜越來越成為我國溫室的主栽蔬菜作物之一。然而,由于溫室的特殊環(huán)境如高溫、高濕等,一些重要的病害嚴重地影響著黃瓜產品的產量和品質。其中,由于霜霉病菌生理小種的變異,先前鑒定的抗病基因dm-,dm-2和dm-3已經不能有效的防治該病害的發(fā)生,使得霜霉病(downy mildew)成為目前黃瓜生產上最重要的病害。因此,尋找新的抗性種質資源培育抗病品種是防治該病害發(fā)生的最經濟

2、、有效、安全的措施。
　　 黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系(5211s)是在黃瓜屬種間雜交(Cucumis hystrix×C.sativus)的基礎上,通過多代回交、自交選育獲得。在中國、美國和荷蘭等地進行苗期和田間接種鑒定,5211S均表現(xiàn)對霜霉病有較高的抗性。為了加速此抗性種質資源在黃瓜育種中的應用,本文初步分離了5211S中抗病相關基因,評價了它們在生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達情況,并且進一步分析了這些抗病基因之間的進化

3、關系,為黃瓜抗病育種奠定了基礎。此外,為了精確分析這些抗病基因的表達情況,我們運用實時定量PCR(qRT-PCR)技術對黃瓜常用內參基因的表達穩(wěn)定性進行了評價。
　　 具體結果如下:
　　 1、黃瓜常用內參基因qRT-PCR表達穩(wěn)定性評價
　　 以黃/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系5211S為材料,通過qRT-PCR技術結合生物學軟件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)評價了十個常用的內參基因在黃瓜

4、不同組織中以及生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達穩(wěn)定性；不同組織包括根、莖和葉,生物脅迫主要為霜霉菌脅迫處理,非生物脅迫包括干旱、高鹽、低溫、高溫及其外源激素如ABA、SA、MeJA、H2O2處理條件。
　　 結果表明:在所有的12個黃瓜樣品中,內參基因EF1α和UBI—ep表達較穩(wěn)定。在黃瓜不同組織中,除了內參基因EF1α和UBI-ep外,TUA也表現(xiàn)較強的表達穩(wěn)定性。在不同激素處理條件下,內參基因UBI-ep和TUA表現(xiàn)較強的

5、表達穩(wěn)定性。然而,在非生物脅迫處理條件下,僅僅內參基因EF1α表現(xiàn)出比較強的穩(wěn)定性?？梢钥闯霾煌瑮l件下,內參基因的表達穩(wěn)定性也不同；EF1α、UBI-ep和TUA最適合的內參基因。因此,我們在分析目的基因表達狀況時,要根據具體的實驗條件選擇具體的內參基因。
　　 2、黃瓜/酸黃瓜漸滲系NBS-LRR類型抗病基因的鑒定、特征及其與霜霉病相關基因的表達分析
　　 根據NBS—LRR類型抗病基因設計兼并引物,以黃瓜抗霜霉病漸滲

6、系5211S基因組DNA為模板,通過PCR技術分離與霜霉病相關的抗病同源基因(也稱為抗病基因同源序列)；運用qRT-PCR技術分析了這些抗病基因在5211S根、莖、葉及其在脅迫條件下的表達情況；并且進一步分析了它們之間的進化關系。
　　 結果表明:共分離獲得了28條NBS-LRR類型抗病基因同源序列,系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明這些抗病基因可以分為4類,分別屬于TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR兩大類抗病基因。進化分析

7、表明,除少數(shù)幾個抗病基因經歷“多樣化選擇”外,“純化選擇”在這些抗病基因進化過程中起著重要的作用。qRT-PCR分析表明他們在5211S根莖葉中是差異表達的；并且外源野生酸黃瓜的漸滲誘發(fā)了部分抗病基因的表達；其中,抗病同源基因CsRGA23的表達量比回交親本“北京截頭”增加了4倍。進一步研究發(fā)現(xiàn),CsRGA23的表達能被霜霉菌及一些信號分子如MeJA,SA,ABA,和H2O2顯著地誘導。表明外源野生酸黃瓜DNA的漸滲誘發(fā)抗病基因同源序列

8、CsRGA23表達量的提高可能涉及到5211S對霜霉病的抗性形成。
　　 3、葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的比較聚類及分子進化分析
　　 為了探明葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的進化模式,我們從GenBank數(shù)據庫中搜索了78條抗病基因,進行了他們之間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析,這將對葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的起源提供了理論基礎。
　　 本文所用78條抗病基因主要來自于黃瓜(43條),甜瓜(14

9、條),南瓜(14條)和西瓜(7條)。系統(tǒng)進化樹明顯地把他們分為兩個不同的分支,即TIR(Toll蛋白和白介素受體)分支和CC(在N端含有一個螺旋結構域的序列)分支,并且進一步可以細分為四個亞分支(TIR1、TIR2、CC1和CC2)。我們發(fā)現(xiàn)在這四個亞分支中,只有TIR1分支表現(xiàn)為物種特異性擴張(黃瓜)；其他三個亞分支都是由兩個或三個物種的序列組成,形成不均勻的分支；表明這些抗病基因在在葫蘆科作物分化后,在黃瓜中進行了特異性擴張。進一步

10、與擬南芥抗病基因序列比較分析發(fā)現(xiàn),除了少數(shù)幾條序列外,絕大多數(shù)的葫蘆科作物抗病基因同源序列在系統(tǒng)進化上與擬南芥不同。此外,序列分析還表明基因重復、序列差異和基因缺失在葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因進化中具有重要的作用。
　　 4、黃瓜/酸黃瓜漸滲系Pto型抗病基因的分離、進化及表達分析
　　 本文通過PCR技術分離黃瓜/酸黃瓜漸滲系的Pto類型抗病同源基因,分析了這些同源基因之間的系統(tǒng)發(fā)育關系,比較研究了他們與番茄

11、Pto(編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白,STK)抗病基因的結構特征,進一步分析了他們在黃瓜基因組中進化方式。
　　 我們共獲得了18條STKs序列,系統(tǒng)發(fā)育分析這些序列分為8類。其中,6類屬于黃瓜Pto型抗性基因同源序列(Pto-RGAs)。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)這些Pto—RGAs都具有番茄Pto抗病基因的典型特征；但也出現(xiàn)氨基酸的缺失和插入現(xiàn)象,如在第133、134位兩個氨基酸的缺失,第160、161、162位氨基酸的插入。另外,這些P

12、to—RGAs抗病基因之間的同義突變與非同義突變的比值(Ka/Ks)均小于1,表明了“純化選擇”在黃瓜/酸黃瓜漸滲系Pto類型抗病基因進化過程中起到了重要的作用。
　　 5、黃瓜/酸黃瓜漸滲系類甜蛋白基因的克隆及表達分析
　　 運用Tail-PCR技術從黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系中分離類甜蛋白(病程相關蛋白PR5同源基因)基因,qRTPCR技術分析了它在根莖葉的表達情況；并且進一步評價它在生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達

13、情況。
　　 結果表明,黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系類甜蛋白基因被命名為CsPR5,該基因長1504 bp,含有726 bp的開放閱讀框,編碼241個氨基酸殘基。BLAST搜索結果表明,該序列與其他物種的PR5同源基因有較高的同源性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)它在根莖葉中是差異表達的；進一步研究表明霜霉菌和一些外源信號物質(SA,MeJA,ABA,和H2O2)能顯著了誘導CsPR5基因的表達。因此,CsPR5基因可能參與了5211S對