霜霉病菌誘導(dǎo)的黃瓜葉片cDNA文庫構(gòu)建及其表達序列標簽(ESTs)分析.pdf

1、黃瓜是全球十大蔬菜栽培作物之一，我國的黃瓜總種植面積及總產(chǎn)量目前已躍居世界首位，而黃瓜霜霉病作為全球范圍內(nèi)黃瓜產(chǎn)區(qū)主要葉部病害之一，嚴重威脅著黃瓜的正常生產(chǎn)。鑒于目前黃瓜霜霉病的分子生物學(xué)研究較少和ESTs分析功能基因組具有的明顯優(yōu)越性，構(gòu)建受霜霉菌侵染的黃瓜葉片cDNA文庫并進行ESTs分析，對于研究黃瓜與霜霉菌互作過程中的基因表達，克隆黃瓜抗霜霉病基因，明了黃瓜的抗病機理具有重要指導(dǎo)意義。
　　 試驗比較了目前常用的十種RN

2、A提取方法對黃瓜不同組織（根、莖、葉和幼果）總RNA的提取效果，進而采用改良SDS法提取接種霜霉病菌后第4h、8h、16h、24h、48h和72h的抗霜霉病黃瓜品種‘649’的葉片總RNA，等量混合作為反轉(zhuǎn)錄模板，使用CreatorTMSMARTTMcDNALibraryConstructionKit構(gòu)建霜霉菌接種初期黃瓜葉片的全長cDNA文庫，從中隨機大規(guī)模挑取陽性克隆進行序列測定并進行全面的生物信息學(xué)分析。主要研究結(jié)果如下：

3、　　 1.黃瓜屬于RNA易提取植物，十種方法基本上都可以從黃瓜四種組織中提取到RNA，但提取效果間存在一定的差異。十種方法對黃瓜葉和幼果中RNA的提取效果普遍優(yōu)于對黃瓜根和莖中RNA的提??；對黃瓜葉片RNA提取效果較好的方法有RNAPlant試劑法和改良SDS法；對黃瓜幼果RNA提取效果較好的方法有Trizol法、SDS法和改良SDS法；十種方法提取黃瓜根和莖中的RNA，在純度方面均不高，但基本上都可保證所提RNA的完整性。
　

4、　 2.cDNA文庫構(gòu)建過程中：確定LD-PCR的循環(huán)數(shù)為21個循環(huán)，發(fā)現(xiàn)cDNA與pDNR-LIB載體以1.5:1比例連接時效果較好。經(jīng)質(zhì)量檢測，獲得的原始文庫滴度為5.5×106pfu·mL-1，重組率約為99％。而擴增后的文庫滴度達6.5×109pfu·mL-1。文庫中包含的插入片段大小在0.5-2.0kb之間，并多在1.0kb左右，最大片段約為2.0kb。
　　 3.從黃瓜cDNA原始質(zhì)粒文庫中隨機挑取3360條陽性克

5、隆進行測序，成功得到3091條ESTs序列，使用SeqClean軟件去除載體序列、重復(fù)序列和長度少于100bp的序列后，最終得到的2903條高質(zhì)量的ESTs序列，所得ESTs序列長度范圍為101-604bp，平均長度414.6bp，GC含量平均為42.44％。
　　 4.使用CAP3軟件對2903條ESTs序列進行聚類拼接，得到2507條非重復(fù)序列（Unigenes），其中包括211個Contigs和2296個Singlets，

6、非冗余序列占全部序列的86.36％，得到的unigenes序列長度范圍為101-1426bp，平均為422.73bp，GC含量平均為38.21％，長度在600bp以上的有53條。
　　 5.基因表達豐度分析表明：在2507條unigenes中，共有高豐度表達基因（表達頻率≥5）18個，約占總數(shù)的0.72％；中豐度表達基因（5>表達頻率≥2）139個，約占總數(shù)的7.69％；其余低豐度表達基因約占91.60％，說明黃瓜葉片中大多數(shù)基

7、因呈低豐度表達。
　　 6.同源性來源分析表明：在2507條unigenes中，共有1653條（占總數(shù)65.94％）在NCBI非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫（nt）中有其匹配序列，序列同源性來源于110多個物種，來源較多的依次是黃瓜（23.29％）、葡萄（13.43％）、楊屬（13.19％）、大豆（10.41％）等。
　　 7.對組裝后的2507條unigenes在NCBI和Swiss-Prot非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進行blastx比對

8、，共獲得超過500種的已知功能蛋白，根據(jù)蛋白類別可將其劃分為四類，將具有已知功能和推測功能的1547個unigenes在UniProt數(shù)據(jù)庫中確定其蛋白功能，構(gòu)建基因表達圖譜，被賦予功能的基因累計達到2231個（包括一因多效），其中參與抗病/防御的基因有427條占19.16％，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的56條占2.51％。
　　 8.對組裝后的2507條unigenes在COG數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果顯示：共有662個unigengs在COG數(shù)據(jù)

9、庫中得到功能注釋信息，涉及23項蛋白功能，其中信息儲存和加工類有351條占53.01％，細胞加工類有44條占6.65％，代謝類有207條占31.27％，防御類有5條占0.76％，功能不明確有55條占8.31％。
　　 9.對組裝后的2507條unigenes序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果顯示：共有1851個unigengs獲得相關(guān)的注釋信息，涉及44個的非重復(fù)代謝途徑，Pathway分析表明：對代謝途徑的注釋主要集中在各類