三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)鰓cDNA文庫的構(gòu)建及其表達序列標簽分析.pdf

1、三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）是世界上最廣泛的一種捕撈蟹類，具有肉質(zhì)好、食物鏈短、生長快、產(chǎn)量較高等優(yōu)點，具有很高的經(jīng)濟價值。三疣梭子蟹是一種廣鹽性蟹，在淡水和海水環(huán)境中都能夠生存。目前，關(guān)于廣鹽性蟹類的滲透調(diào)控機理在生理上已有部分研究報道，而分子水平上的研究較少，對三疣梭子蟹滲透調(diào)控分子機制相關(guān)研究還未見報道。如果能從分子水平上弄清楚這一問題，不僅具有很大的科學價值，而且具有較大的應(yīng)用價值，也可以為其它甲

2、殼動物提供較好的借鑒。為研究該問題，構(gòu)建三疣梭子蟹的滲透調(diào)控器官——鰓的cDNA文庫是其必要前提。而表達序列標簽（Expressed Sequence Tags，ESTs）是了解基因組結(jié)構(gòu)、收集基因組信息和發(fā)現(xiàn)新基因的一種有效且經(jīng)濟的途徑。 本研究以三疣梭子蟹鰓組織為材料，構(gòu)建其全長cDNA文庫；其鰓組織是樣本蟹經(jīng)過不同鹽度適應(yīng)后取得的。通過Trizol Reagent提取總RNA，利用SMART cDNA Library Co

3、nstruction Kit進行cDNA文庫構(gòu)建，連接到pBluescriptⅡSK（+）載體上，轉(zhuǎn)化E.ColiDH-5a宿主菌，庫容量為4.05×105，重組率為97％。 從cDNA文庫中隨機挑選1282個克隆子進行序列測定，得到909條有效EST序列，平均長度為599bp。經(jīng)CAP3軟件組裝后，得到485個轉(zhuǎn)錄本，包括67個重疊群和418個單拷貝。每個重疊群中EST的數(shù)量介于2～197個，以含2個EST的重疊群數(shù)目最多（2

4、4個），平均為8.38個。重疊群的長度介于293～1356bp，平均長度為796bp。 利用美國國立生物技術(shù)信息中心（TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI）的蛋白非冗余數(shù)據(jù)庫（non-redundant proteinse quences，nr），對485個轉(zhuǎn)錄本進行blastx同源比對分析，發(fā)現(xiàn)134個轉(zhuǎn)錄本可以找到同源序列，并記錄最相似的三條序列。最相似的

5、序列用物種進行分類（取期望值即E-value小于10-3），節(jié)肢動物占絕大部分為77％，其中又以甲殼動物居多（49％）；另一種常見的節(jié)肢動物昆蟲也占了相當大的比例（26％）。 對這些基因產(chǎn)物通過基因本體論（GeneOntology，GO）數(shù)據(jù)庫進行功能分析，發(fā)現(xiàn)同源序列功能大致分為7類：抗氧化活性，連接活性，催化活性，調(diào)節(jié)酶活性，分子傳感活性，結(jié)構(gòu)分子活性和其他。三疣梭子蟹鰓cDNA文庫的成功構(gòu)建，為研究該物種的功能基因和蛋白質(zhì)