三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在氨氮脅迫下氨氮代謝終產(chǎn)物排出途徑的研究.pdf

1、在水產(chǎn)養(yǎng)殖體系中，氨氮濃度會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增加，現(xiàn)已成為蟹類健康養(yǎng)殖中一個(gè)主要的生理挑戰(zhàn)。本文通過(guò)運(yùn)用DGE技術(shù)構(gòu)建和分析了三疣梭子蟹在氨氮脅迫下的鰓基因表達(dá)譜，檢測(cè)了氨氮代謝終產(chǎn)物排出相關(guān)的通道蛋白基因表達(dá)水平、尿素和尿酸合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平，測(cè)定了各組織中氨氮代謝終產(chǎn)物含量的變化，深入探討了三疣梭子蟹在氨氮脅迫下的生理適應(yīng)機(jī)制、解毒代謝機(jī)制和代謝產(chǎn)物的排出機(jī)制。本論文主要內(nèi)容包括以下三個(gè)方面:
　　1、應(yīng)用DGE技術(shù)構(gòu)

2、建與分析三疣梭子蟹在氨氮脅迫下鰓基因表達(dá)譜
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)構(gòu)建了三疣梭子蟹在5mg/L NH4Cl脅迫48h下的鰓基因表達(dá)譜。共產(chǎn)生58，336條unigenes，平均長(zhǎng)度為689bp。差異基因功能分類表明在氨氮脅迫下被顯著調(diào)節(jié)的生理過(guò)程主要有氨基酸代謝、核苷酸代謝、線粒體膜電位調(diào)節(jié)、活性氧代謝、抗氧化及免疫響應(yīng)。本文選擇了分別對(duì)與抗氧化系統(tǒng)、線粒體電子傳遞、蛋白質(zhì)消化與吸收、免疫系統(tǒng)相關(guān)的7個(gè)基因進(jìn)行

3、了實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。本研究結(jié)果為更好的理解三疣梭子蟹在氨氮脅迫下分子響應(yīng)機(jī)制提供了極具價(jià)值的基因信息。
　　2、三疣梭子蟹在氨氮脅迫下氨排出途徑的研究
　　本實(shí)驗(yàn)將三疣梭子蟹曝露于不同濃度(0mg/L、1mg/L、5mg/L)的NH4Cl溶液中，研究了氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹血淋巴氨含量的影響;鰓組織中Na+/K+-ATP酶（α亞單位）(NKA)、H+-ATP酶（亞單位A）活力;鰓組織中Rh轉(zhuǎn)氨蛋白(Rh)、K+通道（K+Ch

4、annel）、Na+/K+/2Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC)、Na+/H+交換體(NHE)和與囊泡相關(guān)的膜蛋白(VAMP)基因表達(dá)水平的影響，同時(shí)觀察了鰓組織的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹血淋巴氨含量、鰓組織中NKA與H+-ATP酶活力以及各轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道基因表達(dá)水平有顯著性影響。血淋巴氨含量在氨氮脅迫下均顯著增加，其中1mg/L NH4Cl處理組中血氨含量逐漸增加，并于24h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，5mg/L NH4Cl處理組中血氨含量在

5、實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)呈峰值變化，于24h達(dá)到最大值。鰓組織中NKA與H+-ATP酶活力在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)均呈峰值變化，且均在6h達(dá)到最大值。鰓組織中Rh蛋白與K+通道基因表達(dá)水平在氨氮脅迫下顯著上調(diào)并呈峰值變化，且均于12h達(dá)到最大值;NKCC與NHE基因表達(dá)水平在氨氮脅迫下均顯著下調(diào)，其中1mg/L與5mg/L NH4Cl處理組中NKCC基因表達(dá)水平分別于6h、3h達(dá)到最小值，隨后增加但始終低于對(duì)照組水平，NHE基因表達(dá)水平在前6h內(nèi)顯著下調(diào)，12h

6、恢復(fù)至對(duì)照組水平，隨后又顯著下調(diào)。本文中的所有指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均與外界氨氮濃度呈明顯的劑量效應(yīng)。由此可見(jiàn)，三疣梭子蟹在氨氮脅迫下通過(guò)上調(diào)Rh蛋白、K+通道基因表達(dá)水平，下調(diào)NKCC、NHE基因表達(dá)水平及增加NKA活力共同將體內(nèi)氨氮濃度維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，避免氨氮濃度過(guò)高對(duì)機(jī)體造成毒害影響。VAMP基因表達(dá)水平的增加、H+-ATP酶活的增強(qiáng)以及鰓組織超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明胞吐排氨機(jī)制可能也存在于三疣梭子蟹中。
　　3、三疣梭子蟹在氨氮

7、脅迫下尿酸、尿素代謝途徑與組織分布的研究
　　本實(shí)驗(yàn)研究了氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹氮代謝終產(chǎn)物代謝途徑與組織分布的影響。結(jié)果表明，氨氮脅迫顯著影響了各組織中黃嘌呤氧化酶(XO)、氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ(CPSⅢ)、精氨酸酶(ARG)、尿酸酶(URI)的基因表達(dá)水平，尿酸與尿素含量以及鰓組織中尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(UT)的基因表達(dá)水平。各處理組XO基因表達(dá)水平在肌肉和鰓組織中顯著上調(diào)，而在肝胰腺中顯著下調(diào);各處理組肌肉和鰓組織中CPSⅢ和ARG基因

8、表達(dá)水平均呈峰值變化，且均在12h達(dá)到最大值，肝胰腺中CPSⅢ和ARG基因表達(dá)水平在氨氮脅迫前期明顯受到抑制，而分別在脅迫48h和24h后顯著上調(diào);各處理組URI基因表達(dá)水平在氨氮脅迫下的變化趨勢(shì)與XO的具有一致性;各組織中均檢測(cè)到微量的尿酸，但都僅在少數(shù)取樣點(diǎn)與對(duì)照組水平相比有顯著性變化，尿酸在各組織中的分布情況為:肌肉＞血淋巴＞鰓＞肝胰腺;各組織中尿素含量在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)與對(duì)照組水平相比呈顯著性變化，在5mg/L NH4Cl處理組中其顯

9、著性變化更為明顯，且其含量遠(yuǎn)高于尿酸在各組織中的含量，尿素在各組織中的分布情況為:血淋巴＞鰓＞肝胰腺≈肌肉;鰓組織中尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(UT)基因表達(dá)水平在氨氮脅迫下顯著上調(diào)。由此可見(jiàn)，在氨氮脅迫下三疣梭子蟹會(huì)將體內(nèi)多余的氨轉(zhuǎn)化為尿素和微量的尿酸來(lái)解除毒害作用，其中尿酸可能通過(guò)嘌呤核苷酸分解代謝產(chǎn)生，并多儲(chǔ)存在肌肉組織中，而尿素則可能通過(guò)鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)途徑產(chǎn)生，但不排除是通過(guò)精氨酸酶水解產(chǎn)生的可能性，同時(shí)，通過(guò)嘌呤核苷酸分解代謝產(chǎn)生的尿酸還