吸煙對(duì)哮喘Th1-Th2平衡的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響公共健康的慢性疾病，其發(fā)病率和嚴(yán)重性逐年增高，但原因尚不清楚。流行病學(xué)研究認(rèn)為與兒童期感染機(jī)率下降及環(huán)境中作為危險(xiǎn)因素的污染物增多有關(guān)。其中吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng)吸煙)作為室內(nèi)空氣污染的主要來(lái)源，是哮喘發(fā)病中一個(gè)重要環(huán)境因素。國(guó)外流行病學(xué)資料顯示至少三分之一的哮喘患者經(jīng)常暴露在香煙煙霧環(huán)境中，有資料顯示發(fā)達(dá)國(guó)家至少有50％的成人哮喘患者目前吸煙或曾經(jīng)吸煙。 哮喘是多種細(xì)胞及細(xì)胞組份參與的氣

2、道慢性炎癥，隨病程延長(zhǎng)可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑。吸煙使哮喘本來(lái)就復(fù)雜的病理生理過(guò)程進(jìn)一步復(fù)雜化，吸煙不僅可以引起哮喘頻繁發(fā)作、導(dǎo)致哮喘患者的肺功能迅速下降，而且可以降低哮喘患者糖皮質(zhì)激素的治療效果，因此使哮喘患者病情不易控制。吸煙對(duì)哮喘發(fā)生發(fā)展及臨床表現(xiàn)的影響是復(fù)雜的，相關(guān)的研究報(bào)道很少，具體機(jī)制尚不清楚。 研究表明吸煙和許多疾病如社區(qū)獲得的肺炎，肺癌及呼吸道感染密切相關(guān)，因此認(rèn)為可能與吸煙改變宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。香煙煙

3、霧中的主要成分之一尼古丁，具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠影響免疫監(jiān)視功能，并促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。 輔助性T細(xì)胞1(Th1)/輔助性T細(xì)胞2(Th2)失衡是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，無(wú)論氣道炎癥還是氣道重塑都受到Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)。輔助性T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)，即Th細(xì)胞，可分為T(mén)h1和Th2兩個(gè)亞群，Th1細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子γ干擾素(IFN—γ)、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-12等，可激活巨噬細(xì)胞，在抗病毒感染和胞內(nèi)細(xì)菌感染的免疫

4、應(yīng)答中發(fā)揮作用。Th2細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，參與急性超敏反應(yīng)，對(duì)B細(xì)胞合成所有抗體包括IgE有輔助作用，在對(duì)過(guò)敏原和寄生蟲(chóng)感染的免疫反應(yīng)中起作用。T—bet/GATA-3是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，分別是誘導(dǎo)Th1/Th2極性分化以及分泌相應(yīng)效應(yīng)性細(xì)胞因子的專有性轉(zhuǎn)錄因子。研究認(rèn)為T(mén)—bet/GATA-3表達(dá)變化可間接反映體內(nèi)Th1/Th2類細(xì)胞數(shù)量以及Th1/Th2類細(xì)胞因子表達(dá)水平

5、的動(dòng)態(tài)變化。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)是一類獨(dú)特的CD4+T細(xì)胞，在抑制主動(dòng)免疫及維持免疫耐受中起著關(guān)鍵性作用；叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)在一定程度上可以反映CD4+CD25+Treg的水平和功能活性；新近研究認(rèn)為，Treg可明顯抑制Th1、Th2活化增殖，是在Th1/Th2網(wǎng)絡(luò)平衡之上的更高層次

6、調(diào)控者，并可能在控制支氣管哮喘和過(guò)敏性疾病的發(fā)病中起重要作用。 吸煙對(duì)調(diào)控Th1/Th2平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T—bet、GATA-3的影響未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，吸煙對(duì)Treg的數(shù)量及Foxp3表達(dá)影響的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，在哮喘等氣道炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中成為研究熱點(diǎn)，有望成為新的治療靶點(diǎn)。鑒于上述研究背景和研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，從不同細(xì)胞水平研究吸煙及主要成份尼古丁對(duì)哮喘Th1/

7、Th2免疫平衡的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，一方面深入探討吸煙加重哮喘的免疫學(xué)機(jī)制，另一方面也為哮喘治療探尋新的靶點(diǎn)。 研究?jī)?nèi)容: 1．香煙煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠Th1/Th2細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達(dá)的影響； 2．香煙煙霧提取物對(duì)卵蛋白致敏大鼠脾淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達(dá)的影響； 3．尼古丁對(duì)卵蛋白致敏CD4+T淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子

8、T—bet/GATA-3表達(dá)的影響； 4．香煙煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的影響。 研究方法: 實(shí)驗(yàn)一：香煙煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠Th1/Th2細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達(dá)的影響。 1．復(fù)制動(dòng)物模型：雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘組+煙霧暴露組，每組10只。建立慢性哮喘大鼠模型(1％OVA霧化激發(fā)8周，1次

9、/天，5天/周)和慢性哮喘大鼠吸煙模型(吸煙和OVA霧化激發(fā)同時(shí)開(kāi)始，1次/天，5天/周，共8周)。 2．HE染色觀察各組大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及支氣管壁厚度變化。 3．Masson染色觀察各組氣道膠原含量。 4．ELISA法測(cè)定肺組織和血漿IFN—γ/IL-4含量。 5．Westernblot法檢測(cè)肺組織T—bet/GATA-3蛋白表達(dá)。 6．QuantitiverealtimeRT-PCR檢測(cè)肺

10、組織T—bet/GATA-3mRNA表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：香煙煙霧提取物對(duì)卵蛋白致敏大鼠脾淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達(dá)的影響。 1．大鼠OVA致敏和脾淋巴細(xì)胞的分離：6-8周齡雄性Wistar大鼠，第1天、8天分別腹腔內(nèi)注射OVA和氫氧化鋁混合液致敏，第15天麻醉動(dòng)物無(wú)菌取脾，分離脾淋巴細(xì)胞。 2．不同濃度香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)的干預(yù)

11、：將脾淋巴細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、0.5％CSE組、1％CSE組、2％CSE組，同時(shí)各孔均加入OVA作為特異性刺激物，CSE作用24小時(shí)。 3．ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN—γ/IL-4含量。 4．QuantitativerealtimeRT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞T—bet/GATA-3mRNA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三：尼古丁對(duì)OVA致敏大鼠CD4+T細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子和T—bet/GATA-3表達(dá)的影響

12、。 1．大鼠OVA致敏：方法同實(shí)驗(yàn)二。 2．CD4+T細(xì)胞的分離及不同濃度尼古丁的干預(yù)：大鼠CD4+T純化柱分離CD4+T細(xì)胞，將CD4+T細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照、1μg/ml尼古丁組、10μg/ml尼古丁組、100μg/ml尼古丁組，同時(shí)各孔均加入OVA作為特異性刺激物，尼古丁刺激24小時(shí)。 3．ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-4和IFN—γ含量。 4．QuantitiverealtimeRT-PC

13、R檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞T—bet/GATA-3mRNA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)四：香煙煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的影響。 1．復(fù)制動(dòng)物模型：同實(shí)驗(yàn)一。 2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。 3．Westernblot法檢測(cè)肺組織Foxp3蛋白的表達(dá)。 研究結(jié)論: 1．香煙煙霧暴露可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA

14、-3表達(dá)，進(jìn)而加重哮喘大鼠Th1/Th2失衡，在哮喘的氣道炎癥及氣道重塑中扮演重要角色。 2．尼古丁在吸煙加重哮喘的Th1/Th2失衡中起重要作用。 3.2個(gè)月卵蛋白霧化激發(fā)哮喘模型中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例下調(diào)，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)下降，二者可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。 4．香煙煙霧暴露降低轉(zhuǎn)錄因子的Foxp3蛋白表達(dá)及下調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例，可能為吸煙加重哮喘Th1/T