補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)哮喘緩解期患兒Th1-Th2平衡機(jī)理的研究.pdf

1、目的：從轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子不同層面了解評(píng)價(jià)哮喘緩解期患兒體內(nèi)Th1/Th2免疫平衡的狀況。觀察補(bǔ)腎(陽(yáng))中藥體外干預(yù)對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)作用，探討其治療哮喘的機(jī)制。 方法： 第一部分：哮喘緩解期患兒體內(nèi)Th1/Th2平衡狀況的研究1 ELISA法檢測(cè)24名哮喘緩解期患兒(病例組)與12名對(duì)照組兒童血清IFN-γ濃度和IL-4濃度。 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)24名哮喘緩解期患兒與12名對(duì)照組兒童外周血

2、單個(gè)核細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3mRNA水平的表達(dá)。 第二部分：補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡機(jī)理的研究1 哮喘緩解期兒童20例，抽取靜脈抗凝血3ml，無(wú)菌條件下Ficoll法分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。每一個(gè)哮喘患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞平均分為3部分，分為對(duì)照組、治療Ⅰ組和治療Ⅱ組，分別加入RPMI-1640培養(yǎng)液、3％的補(bǔ)腎中藥提純制劑(喘可治注射液)、1.5％的補(bǔ)腎中藥提純制劑(喘可治注射液)，37℃、5％CO<,2

3、>于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞沉淀。 2 抽提RNA、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)T-betmRNA、GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度及細(xì)胞因子IFN-γmRNA、IL-4mRNA的表達(dá)水平。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 第一部分： 1.病例組血清IFN-γ的水平低于對(duì)照組，但兩者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

4、義(P>0.05)。病例組血清中IL-4的水平顯著高于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.病例組PBMC中T-betmRNA的表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組降低，但兩者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.病例組與對(duì)照組相比IFN-γ/IL-4及T-bet/GATA-3的比值均顯著降低(P<0.05，P<0.01)．。 4.以T-

5、bet/GATA-3的比值為自變量，以IFN-γ、IL-4為因變量分別建立一元線性回歸方程，可見(jiàn)IFN-γ、IL-4的數(shù)值變化與T-bet/GATA-3的比值密切相關(guān)。 第二部分： 5.體外培養(yǎng)48h后，對(duì)照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組三組之間比較，T-betmRNA、IFN-γmRNA、IL-4mRNA的表達(dá)強(qiáng)度均有顯著性差異(P<0.05)，GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度在三組之間無(wú)顯著性差異。 6.不同劑量補(bǔ)腎中

6、藥干預(yù)后，PBMC中T-betmRNA的表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)；均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以治療Ⅱ組的差異更為明顯(P<0.01)；治療組與對(duì)照組相比GATA-3mRNA的表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯差異；治療組的PBMC中IFN-γmRNA的表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，其中治療Ⅱ組較對(duì)照組增強(qiáng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組的PBMC中IL-4mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組減低，其中治療Ⅱ組IL-4mRNA的表達(dá)強(qiáng)度顯著減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

7、1)。 7.體外培養(yǎng)48h后，對(duì)照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組三組之間比較，T-bet/GATA-3的比值無(wú)顯著性差異，IFN-γ/IL-4的比值有顯著性差異(P<0.05)8 治療組的T-bet/GATA-3的比值均較對(duì)照組升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組的IFN-γ/IL-4的比值較對(duì)照組上升，其中治療Ⅱ組與對(duì)照組相比IFN-γ/IL-4的比值顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1.哮喘緩解期患兒外周血P

8、BMCs中GATA3mRNA表達(dá)水平顯著高于正常兒童(P<0.05)，血清中IL-4的水平亦顯著高于正常兒童(P<0.05)，提示哮喘緩解期患兒體內(nèi)存在Th2細(xì)胞功能的亢進(jìn)。 2.哮喘緩解期患兒與正常兒童相比IFN-γ/IL-4及T-bet/GATA-3的比值均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，提示哮喘緩解期患兒在基因和蛋白質(zhì)水平均存在Th1/Th2平衡的紊亂。 3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎中藥可以上調(diào)PBM

9、C中IFN-γmRNA的表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)下調(diào)IL-4mRNA的表達(dá)(P<0.05)，使IFN-γ/IL-4的比值顯著升高(P<0.05)。據(jù)此認(rèn)為補(bǔ)腎中藥可以通過(guò)上調(diào)Th1類細(xì)胞因子同時(shí)下調(diào)Th2類細(xì)胞因子，糾正Th1/Th2細(xì)胞因子的比值失衡，推測(cè)這可能是其調(diào)節(jié)免疫治療哮喘的機(jī)制之一。 4.補(bǔ)腎中藥提純制劑(CKZ注射液)體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，治療組細(xì)胞沉淀中T-betmRNA的表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.01