HSP70-CD80嵌合DNA疫苗通過調(diào)節(jié)Th1-Th2平衡對(duì)哮喘小鼠氣道重建的影響.pdf

1、目的：氣道重建（airway remodeling）是支氣管哮喘的重要病理生理學(xué)特征。哮喘患者隨著疾病的進(jìn)展，其肺功能進(jìn)行性惡化，氣道重建是其中的重要因素。研究表明，Th1/Th2平衡失調(diào)是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機(jī)制。主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞數(shù)目增多、功能亢進(jìn)。因此研究如何促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而控制哮喘變態(tài)反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展成為人們普遍關(guān)注的熱點(diǎn)。T-bet和GATA-3是在Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞和Th2

2、細(xì)胞過程中起重要作用的兩種轉(zhuǎn)錄因子。大量研究證實(shí)T-bet低表達(dá)和GATA-3高表達(dá)的小鼠表現(xiàn)出哮喘氣道重建的特征，故而說明在氣道重建中，T-bet/GATA-3比率的失衡可能發(fā)揮重要作用。在本研究小組以前的實(shí)驗(yàn)中，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗在小鼠結(jié)核病的防治中顯示了明顯免疫預(yù)防及治療作用，該嵌合疫苗對(duì)結(jié)核桿菌生長有很強(qiáng)的抑制作用，小鼠IFN-γ明顯增高。結(jié)核桿菌HSP70與人CD80蛋白都不是結(jié)核桿菌的特異抗原，對(duì)小鼠結(jié)核的防

3、治作用說明其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)IFN-γ分泌增多，加強(qiáng)Th1型反應(yīng)，并抑制Th2反應(yīng)，達(dá)到機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)并發(fā)揮對(duì)結(jié)核桿菌的抑制和殺滅作用。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為HSP70/CD80嵌合疫苗對(duì)Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用也可應(yīng)用于其它免疫失衡的疾病，作為一種廣譜疫苗用于多種疾病的防治。在本研究中，我們以雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠為模型，觀察HSP70/CD80嵌合疫苗對(duì)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性（hyperresp

4、onsiveness，AHR）和氣道重建的預(yù)防性作用，并探討其可能的機(jī)制，為臨床哮喘病及其它變應(yīng)性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期獲得免疫原性強(qiáng)、安全可靠的新型免疫調(diào)節(jié)性疫苗。方法：鑒定HSP70/CD80嵌合DNA真核表達(dá)質(zhì)粒。按照QIAGEN公司去內(nèi)毒素級(jí)質(zhì)粒大量抽提試劑盒說明書制備pcDNA3.1質(zhì)粒和HSP70/CD80嵌合質(zhì)粒。核酸定量儀測定所提質(zhì)粒含量和純度，將質(zhì)粒溶于生理鹽水。將40只雌性健康BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照

5、組、哮喘組、pcDNA3.1載體組和HSP70/CD80嵌合DNA疫苗組，每組10只。將pcDNA3.1質(zhì)粒和HSP70/CD80嵌合質(zhì)粒分別給載體組和疫苗組小鼠注射后，用OVA致敏小鼠。哮喘組用OVA致敏建立哮喘模型，對(duì)照組用生理鹽水代替。最后一次OVA激發(fā)后24 h，通過全身體積描記儀檢測吸入乙酰甲膽堿后小鼠氣道反應(yīng)性，以Penh（enhanced pause）較基線增高的倍數(shù)來反映支氣管反應(yīng)性的高低；常規(guī)蘇木素-伊紅（hemato

6、xylin-eosin，HE）染色觀察小鼠肺組織氣道重建病理學(xué)改變；過碘雪夫酸（periodic acid-schiff，PAS）染色觀察杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況；Masson三色染色觀察氣道壁膠原沉積；免疫組化增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）染色觀察氣道平滑肌增生情況；用ELISA方法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF

7、）中γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）含量的變化；Real-Time PCR檢測脾臟組織T-bet、GATA-3基因的表達(dá)水平。結(jié)果：1.給予不同濃度乙酰甲膽堿刺激后，哮喘組和載體組小鼠的氣道反應(yīng)性較對(duì)照組明顯增高，在乙酰甲膽堿濃度達(dá)6 mg/ml后，哮喘組、載體組小鼠較對(duì)照組小鼠開始有明顯差異（P<0.050）；在乙酰甲膽堿濃度達(dá)6 mg/ml后，疫苗組小鼠較哮喘

8、組開始有明顯差異（P<0.050）。2.與對(duì)照組比較，哮喘組和載體組小鼠氣道壁增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。與哮喘組相比，疫苗組能有效改善氣道重建，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。3.與對(duì)照組比較，哮喘組、載體組支氣管上皮中PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）；與哮喘組相比，疫苗組能有效抑制杯狀細(xì)胞增生，數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。4.哮喘組和載體組氣道上皮下呈藍(lán)色的膠

9、原纖維明顯增厚；對(duì)照組和疫苗組上皮下僅有少量藍(lán)色的膠原纖維沉積。5.與對(duì)照組比較，哮喘組、載體組支氣管上皮下肌層增生明顯，總平滑肌細(xì)胞和PCNA陽性的平滑肌細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）；與哮喘組相比，疫苗組能有效抑制平滑肌細(xì)胞增生，總平滑肌細(xì)胞和PCNA陽性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。6.與對(duì)照組比較，哮喘組和載體組BALF中IFN-γ和IFN-γ，/IL-4的分泌減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P<0.050）：與哮喘組相比，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗組能增加BALF中IFN-γ和IFN-γ/IL-4含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。7.與哮喘組相比，疫苗組T-bet/GATA-3升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050）。結(jié)論：1.鑒定HSP70/CD80嵌合DNA質(zhì)粒與預(yù)期相符，為進(jìn)一步研究其在動(dòng)物體內(nèi)的免疫學(xué)效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。2.HSP70/CD80嵌合DNA疫苗可降低氣道阻力，減輕黏液分泌、上皮下膠原沉積