新型魚腥草素衍生物對(duì)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞及NIH-3T3細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心血管疾病的重要原因之一。日益增多的證據(jù)表明，AS是一種對(duì)血管損傷的過(guò)度炎癥反應(yīng)。血管損傷后，單核細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞粘附到血管壁，釋放一系列細(xì)胞因子和肽類生長(zhǎng)因子，與特異性受體結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)影響血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）和血管外膜成纖維細(xì)胞（adventitial fibroblasts，AF）表型和生長(zhǎng)的信號(hào)，因此促進(jìn)

2、了晚期纖維增殖病變的發(fā)生。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，它是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，可從多種不同的炎癥細(xì)胞中釋放，在AS的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）類的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多糖syndecans家族的成員之一。它是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一，作為一種與生長(zhǎng)因子結(jié)合的共受體（co-

3、receptor），調(diào)控著多種細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞伸展、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖中扮演著重要的角色，同時(shí)也介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。魚腥草廣泛分布于自然界，是中國(guó)藥典收載的傳統(tǒng)中藥品種，有多年抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等臨床應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)和歷史。魚腥草素（houttnin）作為魚腥草的主要成分之一，七十年代已完成了人工的化學(xué)合成，現(xiàn)代藥理研究表明，魚腥草素具有一定的抗炎、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等作用，其藥效團(tuán)為β-醛酮結(jié)構(gòu)。 研究目的:

4、 本課題以抗炎活性單體魚腥草素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后獲得的一種低毒高效的新型魚腥草素衍生物（new houttnin derivative，NHD）為觀察對(duì)象，通過(guò)建立體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，了解NHD對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠VSMCs及NIH/3T3細(xì)胞的增殖和syndecan-4蛋白表達(dá)的影響，爭(zhēng)取獲得其新的生物活性，為拓寬NHD的臨床應(yīng)用范圍提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.細(xì)胞增殖的檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)一：應(yīng)用96孔板體外培養(yǎng)

5、大鼠VSMCs，分別以終濃度為TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD8μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL作用24小時(shí)，每組濃度設(shè)12個(gè)復(fù)孔，同樣實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)2次，每組共24例數(shù)據(jù)，并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較，對(duì)照組共24例數(shù)據(jù)，以明確應(yīng)用NHD是否能抑制TNF-α引起的VSMCs增殖。采用MTS/PMS法確定VSMCs的增殖狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)二：96孔板體

6、外培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞，分別以終濃度為TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD8μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL作用24小時(shí)，每組濃度設(shè)7個(gè)復(fù)孔，同樣實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3次，每組共21例數(shù)據(jù)，并設(shè)立做為對(duì)照組進(jìn)行比較，對(duì)照組共21例數(shù)據(jù)，以明確應(yīng)用NHD是否能抑制TNF-α引起的NIH/3T3細(xì)胞增殖。采用MTS/PMS法確定NIH/3T3細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

7、 2.Syndecan-4蛋白表達(dá)的檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)一：體外培養(yǎng)大鼠VSMCs，分別以終濃度為TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD8μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL作用24小時(shí)，并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較。裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用Western blot蛋白免疫印跡法測(cè)定大鼠VSMCs syndecan

8、-4蛋白的表達(dá)情況。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 實(shí)驗(yàn)二：體外培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞，分別以終濃度為TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD8μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL、TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL作用24小時(shí)，并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較。裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用Western blot蛋白免疫印跡法測(cè)定NIH/3T3細(xì)胞syndecan-4蛋白的

9、表達(dá)情況。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 結(jié)果: 1.NHD對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖的影響; 在藥物分別或共同作用24小時(shí)的條件下，各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組1.262±0.105，TNF-α20ng/mL組1.505±0.137，NHD4μg/mL組1.282±0.110，NHD8μg/mL組1.217±0.108，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組1.325±0.122，TNF-α20ng/mL聯(lián)

10、用NHD8μg/mL組1.228±0.111。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α20ng/mL組能刺激大鼠VSMCs的增殖（t=-6.894，P<0.001），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較有抑制細(xì)胞增殖的作用（P<0.001），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較有抑制細(xì)胞增殖的作用（P<0.001）。 2.NHD對(duì)TNF-α誘導(dǎo)

11、的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表達(dá)的影響; 以對(duì)照組目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值為1，各組syndecan-4蛋白表達(dá)結(jié)果分別為：TNF-α20ng/mL組1.321±0.052，NHD4μg/mL組1.004±0.111，NHD8μg/mL組0.902±0.667，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組1.029±0.070，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組0.991±0.0

12、46。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α20ng/mL組能刺激大鼠VSMCs syndecan-4蛋白的表達(dá)（t=-10.766，P=0.009），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較能抑制syndecan-4蛋白的表達(dá)（P=0.001），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較能抑制syndecan-4蛋白的表達(dá)（P<0.001）。 3.N

13、HD對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NIH/3T3細(xì)胞增殖的影響在藥物分別或共同作用24小時(shí)的條件下，各組細(xì)胞的增殖率分別為：對(duì)照組0.577±0.052，TNF-α20ng/mL組0.621±0.041，NHD4μg/mL組0.514±0.149，NHD8μg/mL組0.490±0.155，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組0.52±0.112，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組0.420±0.149。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)

14、照組比較，TNF-α20ng/mL組能刺激NIH/3T3細(xì)胞的增殖（t=-3.098，P=-0.004），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較有抑制細(xì)胞增殖的作用（P=0.003），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較有抑制細(xì)胞增殖的作用（P<0.001）。 4.NHD對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NIH/3T3細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)的影響;

15、 以對(duì)照組目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值為1，各組syndecan-4蛋白表達(dá)結(jié)果分別為TNF-α20ng/mL組1.305±0.042，NHD4μg/mL組0.988±0.038，NHD8μg/mL組0.963±0.021，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組1.0134±0.027，TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組0.990±0.016。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α20ng/m

16、L組能刺激NIH/3T3細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)（t=-12.706，P<0.001），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD4μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較能抑制syndecan-4蛋白的表達(dá)（P<0.001），TNF-α20ng/mL聯(lián)用NHD8μg/mL組與TNF-α20ng/mL組比較能抑制syndecan-4蛋白的表達(dá)（P<0.001）。 結(jié)論: 本研究證明了一定劑量的NHD能夠抑制TNF-