骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠暴發(fā)性肝功能衰竭及其機制的初步研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其鑒定
　　 目的：分離、培養(yǎng)、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；并通過流式細(xì)胞儀技術(shù)對其進行鑒定。
　　 方法：采用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)篩選法分離純化大鼠MSCs。分析培養(yǎng)過程中細(xì)胞出現(xiàn)的分化表型，判斷是否為MSCs。
　　 結(jié)果：大鼠MSCs呈梭形，漩渦狀方式生長，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測MSCs表型：CD90.1高表達(99.2％)，CD29高表達(98.9％)，CD34低表達(

2、0.5％)，CD45低表達(0.9％)?？赏茰y培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。
　　 結(jié)論：采用全骨髓貼壁篩選法可以成功分離培養(yǎng)出高純度大鼠MSC。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠肝功能衰竭
　　 目的：采用MSC尾靜脈移植治療肝衰竭大鼠，并且與模型對照組及正常對照組進行比較，觀察各組大鼠的肝功能、生存率、MSCs的歸巢情況、肝組織病理改善情況、TNF-α水平。
　　 方法：將按第一部分方法培養(yǎng)出的大鼠

3、MSCs用DAPI進行標(biāo)記；采用CCL4灌胃的方法制作大鼠暴發(fā)性肝功能衰竭模型，分為實驗組和模型對照組，空白對照組大鼠灌服生理鹽水；將標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植入實驗組和正常對照組，模型對照組尾靜脈注射等量的生理鹽水；實驗組與模型對照組進行比較，持續(xù)觀察并記錄2組大鼠一般狀況、生存率等情況，分別于術(shù)后7d、14d處死兩組大鼠，檢測肝功能及肝臟病理變化，ELISA法檢測TNF-α水平；冰凍切片后熒光顯微鏡下觀察MSCs歸巢至肝臟的情況，并與正

4、常對照組比較。
　　 結(jié)果：DAPI可成功標(biāo)記MSCs，細(xì)胞標(biāo)記效率達98％；造模后大鼠24小時內(nèi)逐漸進入肝衰竭狀態(tài)，表現(xiàn)為拒食，活動明顯減少，萎靡、嗜睡或逐漸發(fā)展為昏迷狀態(tài)，對外界刺激反應(yīng)較遲鈍或至無反應(yīng)，全身毛蓬松，尿失禁，尿色深黃，便溏，解剖發(fā)現(xiàn)中毒性鼓腸，皮下或粘膜下有出血點；生化檢查發(fā)現(xiàn)肝功能嚴(yán)重?fù)p害，組織學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞大片壞死、大量炎性細(xì)胞浸潤；從移植術(shù)后3d開始，實驗組存活大鼠一般情況比模型對照組好轉(zhuǎn)更加明顯，移

5、植術(shù)后7d時，實驗組與模型對照組比較，ALT指標(biāo)、生存率、TNF-α水平均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，病理切片炎癥改善情況實驗組更為明顯；移植術(shù)后14d時實驗組與模型對照組比較，肝功能指標(biāo)、生存率、TNF-α水平均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，病理切片炎癥改善情況實驗組更為明顯；移植術(shù)后7d及14d，實驗組MSC歸巢細(xì)胞逐漸增多，空白對照組只觀察到很少量歸巢細(xì)胞。
　　 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)經(jīng)尾靜脈同種異體移植