骨髓間充質(zhì)干細胞增加大鼠黃疸肝臟選擇性門靜脈結扎后肝功能儲備的研究.pdf

1、第一部分，目的:梗阻性黃疸(OJ,Obstructivejaundice),是肝膽胰外科常見的臨床病理狀態(tài)之一。為了更好地了解其發(fā)病機制,學者已經(jīng)嘗試建立了多種大鼠梗阻性黃疸引流模型,但膽管堵塞、腸道返流等并發(fā)癥仍常見。本研究利用顯微外科技術,建立了一個穩(wěn)定的大鼠梗阻性黃疸內(nèi)引流模型。
　　方法:經(jīng)過預實驗研究,我們制定了規(guī)范的手術程序。所有的操作均在顯微鏡下進行。第一次開腹建立黃疸模型,往胰腺端膽總管插入引流管約3mm長,腹壁固

2、定;二次開腹時引流管放入肝臟側擴張的膽管,并確認結扎固定牢固。測量大鼠肝重、體重,生化檢測,超聲檢查,超聲彈性成像,病理檢查,檢驗引流后肝切除耐受能力等,評估新型模型的穩(wěn)定性。
　　結果:大鼠黃疸7天內(nèi)引流后,體重開始上升,血糖和白蛋白恢復到正常水平,營養(yǎng)狀態(tài)明顯好轉;未見后期膽管返流、堵塞等并發(fā)癥。在術后第一天,少數(shù)大鼠可見一過性的淀粉酶和脂肪酶升高,但很快下降到正常水平。膽管引流后,各項生化指標,肝重體重比,超聲彈性值,肝臟病

3、理改變均可恢復到正常水平。膽道引流七天后,有六只大鼠行85％肝切除,全部存活;術后肝再生好。
　　結論:采用顯微外科技術,我們建立了一個新型穩(wěn)定的大鼠梗阻性黃疸內(nèi)引流模型,特別適合于需要做長期膽道引流的研究。
　　第二部分，目的:肝門部膽管癌(Hilarcholangiocarcinoma,HCCA)侵襲性強。為達到無瘤切緣,常要進行大范圍肝切除,但帶來嚴重的近期并發(fā)癥是殘留肝臟的功能衰竭。近年來,骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC

4、s,bonemarrowderivedmesenchymalstemcells)被用于肝病臨床治療和基礎研究。本研究旨在探析選擇性膽管引流(SBD,Selectivebiliarydrainage)聯(lián)合選擇性門靜脈結扎(SPVL,SelectivePortalveinligation),附加BMSCs治療后,能否更快更多的增加黃疸肝臟的肝功能儲備。
　　方法:全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠原代BMSCs。流式細胞技術鑒定細胞表型;經(jīng)不同

5、方式誘導,茜素紅染色檢驗成骨分化能力,油紅O染色檢驗成脂能力。建立黃疸模型后,動物被隨機分為三組,分別為SBD組,SBD+SPVL組和SBD+SPVL+BMSCs干預組。每組分三個觀察時間點,分別為干預后第1、3、7天。觀察比較三組之間肝重體重比、脾重體重比、99mTc-GSA放射性計數(shù)、ICG清除率測試、血清生化指標的差異。Westernblot法檢測肝組織中緊密連接蛋白Occludin表達;ELISA法檢測IL-1β在肝臟的表達;免

6、疫組織化學法觀察增生肝臟Ki-67表達。
　　結果:成功培養(yǎng)雄性大鼠原代BMSCs。流式細胞儀檢測結果顯示,培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs表達CD90,陽性率為93.28%;細胞在體外可被誘導,具備成骨和成脂分化能力。大鼠OJ14天后,超聲楊氏彈性模量值較OJ7天時顯著升高,此時肝臟耐受70%肝切除能力差,所以選擇,建立黃疸14天大鼠模型,進行實驗干預。SPVL后,BMSCs門靜脈輸入可以加快非結扎側肝臟更快的生長,并且結扎側肝臟的萎

7、縮更加明顯。CM-Dil標記的BMSCs,在術后24小時,聚集于大血管周圍;術后7天,隨著細胞的分裂遷移,在肝臟實質(zhì)呈彌漫分布,同時CM-Dil膜標記隨細胞分裂減弱。干預后第1、3天,SBD+SPVL+BMSCs組下肝葉的放射性計數(shù)顯著高于SBD+SPVL組,分別為192.3±15.8vs.158.7±23.1和274.2±10.2vs.225.3±29.8,p<0.05;第7天兩組之間差異不顯著。和SBD+SPVL組相比,在干預后第3

8、、7天,SBD+SPVL+BMSCs組的血清TBIL和ALP值降得更快更低。SBD+SPVL+BMSCs組增生側肝臟組織IL-1β濃度低于其余兩組,在第1、3天表現(xiàn)的更加明顯。SBD+SPVL+BMSCs組增生肝臟Ki-67陽性細胞數(shù)在干預后迅速上升,第三天時占到22±5%。Occludin蛋白的表達在第三天時明顯升高,以SBD+SPVL+BMSCs組的升高最為明顯,在干預后第7天時仍維持在高水平。
　　結論:選擇性膽道引流聯(lián)合非