人臍帶間充質(zhì)干細胞旁分泌物質(zhì)治療暴發(fā)性肝衰竭的實驗研究.pdf

1、目的：探索人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells，UC-MSCs)旁分泌物質(zhì)對實驗性暴發(fā)性肝衰竭大鼠的治療作用，并研究其對大鼠肝細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測UC-MSCs的表面標志，制備含有UC-MSCs旁分泌物質(zhì)的條件培養(yǎng)基(MSC-CM)，腹腔注射D-氨基半乳糖制備暴發(fā)性肝衰竭大鼠模型。實驗分組：MSC-C

2、M組、生理鹽水(NS)組和促肝細胞生長素(PHGF)組，在模型制備后24h從大鼠尾靜脈分別注射三組治療藥物。每組8只大鼠治療后12h、24h、36h、60h分別內(nèi)眥取血測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和總膽紅素(TBIL)的含量。每組另取5只大鼠在治療后36h取肝臟組織制備切片進行HE染色、PCNA免疫組織化學染色以及TUNEL染色，檢測大鼠肝組織中炎性細胞浸潤情況以及肝細胞增殖和凋亡的情況。并在無菌條件下取大鼠肝組織-80℃冷藏，提取RNA，

3、RT-PCR法檢測大鼠肝組織中HGF、EGF、HB-EGF、TNF-a、OSM等基因的表達情況。同時取大鼠外周血，ELISA法檢測大鼠血清中細胞因子TNF-a和IL-10的含量。剩余每組10只大鼠治療后密切觀察并記錄生存狀態(tài)及生存時間，進行生存分析。
　　 結(jié)果：1.膠原酶及胰酶兩步法可有效消化臍帶，使臍帶間充質(zhì)干細胞易于分離獲得，收集細胞后進行原代培養(yǎng)，24小時后光鏡下可觀察到貼壁細胞，其形態(tài)為長梭形、不規(guī)則形，細胞大小不一，

4、類似成纖維細胞，呈漩渦樣生長。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，細胞高表達CD29、CD49、CD90、CD105及HLA-I，低表達造血細胞表型CD34、CD45及內(nèi)皮細胞表型CD31，低表達CD14、HLA-DR。2.大鼠血清中ALT及TBIL含量檢測發(fā)現(xiàn)，MSC-CM組及PHGF組大鼠治療后24hALT及TBIL的含量均低于NS組(P<0.05)，而MSC-CM組與PHGF組比較差異無統(tǒng)計學意義。3.ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，MSC-CM組與PHG

5、F組大鼠血清中TNF-a含量均低于NS組(P<0.05)，而IL-10含量均高于NS組(P<0.05)，MSC-CM組與PHGF組比較大鼠血清中TNF-a及IL-10含量無統(tǒng)計學差異。4.大鼠治療后36h肝臟切片PCNA染色顯示，MSC-CM組與PHGF組中PCNA陽性肝細胞數(shù)均高于NS組(P<0.01)，MSC-CM組與PHGF組比較差異無統(tǒng)計學意義。TUNEL染色顯示，MSC-CM組與PHGF組中TUNEL陽性肝細胞數(shù)均低于NS組(

6、P<0.05)，MSC-CM組與PHGF組比較差異無統(tǒng)計學意義。5.RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，MSC-CM組與PHGF組大鼠肝組織中5個基因的表達與NS組大鼠相比大約升高2-4倍(P<0.05)，MSC-CM組與PHGF組比較差異無統(tǒng)計學意義。6.三組大鼠進行生存分析發(fā)現(xiàn)，MSC-CM組與PHGF組大鼠的生存率均高于NS組(P<0.05)，而MSC-CM組與PHGF組比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：經(jīng)酶消化法可從臍帶中獲得大量細