臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝衰竭的臨床前研究.pdf

1、第一部分、C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及其熒光標(biāo)記的鑒定
　　 目的：
　　 建立小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UMSCs)的分離與體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的方法；證明從C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶分離得到的UMSCs在體外可以穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，從而為移植細(xì)胞的體內(nèi)示蹤提供有利工具。
　　 方法：
　　 取孕16天C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，采用

2、膠原酶和胰酶兩步法分離出單個(gè)UMSCs，貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)、純化：觀察細(xì)胞形態(tài)特征及生長(zhǎng)狀態(tài)；流式細(xì)胞儀測(cè)定其表面標(biāo)志；進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)及鑒定；在熒光顯微鏡下觀察不同代細(xì)胞EGFP的表達(dá)，收集不同代的細(xì)胞鑒定EGFP基因及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．膠原酶和胰酶兩步法消化臍帶可獲得大量單個(gè)細(xì)胞，在體外可以穩(wěn)定的生長(zhǎng)、擴(kuò)增。2．倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，束狀密集平行或旋渦狀排列。3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，分離

3、得到的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)抗原標(biāo)記CD90和CD106，但不表達(dá)CD34和CD45。4．在體外誘導(dǎo)下，分離得到的細(xì)胞可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化。5．熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)。6.EGFP基因PCR結(jié)果表明各代細(xì)胞均穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因；免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)EGFP的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 成功的建立了小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UMSCs)的分離與體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的方法：證明了從C57BL/6J-EG

4、FP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶分離得到的UMSCs各代能穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)。
　　 第二部分、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭小鼠的療效觀察及移植細(xì)胞的體內(nèi)示蹤
　　 目的：
　　 用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖建立小鼠急性肝衰竭模型；評(píng)價(jià)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UMSCs)移植治療急性肝衰竭的療效；觀察在體示蹤增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因標(biāo)記的UMSCs的可行性，以及標(biāo)記干細(xì)胞在模型動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布。<

5、br>　　 方法：
　　 用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖腹腔注射的方法建立小鼠急性肝衰竭模型。建模6h后將模型隨機(jī)分為：UMSCs移植組、生理鹽水對(duì)照組，比較兩組小鼠治療前后一般情況，不同時(shí)間點(diǎn)肝功能恢復(fù)情況，肝臟病理改變情況結(jié)果。取不同時(shí)間點(diǎn)UMSCs移植組小鼠肺、肝組織做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光標(biāo)記細(xì)胞在肺、肝組織的遷移和分布規(guī)律。取不同時(shí)間點(diǎn)UMSCs移植組小鼠的肝臟組織，利用相對(duì)定量RT-PCR對(duì)綠色熒光蛋白

6、基因進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)UMSCs量的變化進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 UMSCs移植組小鼠存活率(40％)顯著高于生理鹽水對(duì)照組(10％)，肝臟功能及肝臟病理均有部分改善。移植后24h，肝臟損傷區(qū)未見(jiàn)標(biāo)記細(xì)胞，移植后3d，標(biāo)記的UMSCs開(kāi)始遷移、聚集在損傷肝臟。相對(duì)定量RT-PCR顯示EGFP基因在肝臟內(nèi)3d時(shí)表達(dá)量是24h時(shí)的1.66倍，在1月時(shí)表達(dá)量是24h時(shí)的5.17倍。
　　 結(jié)論：
　　 移植

7、同種異體UMSCs對(duì)于急性肝衰竭小鼠具有明顯的治療作用。經(jīng)尾靜脈移植的EGFP熒光標(biāo)記的UMSCs能夠向受損的肝臟遷移并定植。
　　 第三部分、示蹤技術(shù)在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用
　　 盡管干細(xì)胞移植治療肝臟疾病在基礎(chǔ)研究及臨床已經(jīng)取得了一定的成果，但關(guān)于干細(xì)胞移植后的歸巢狀況、在全身及肝臟局部停留的時(shí)間及定植能力均不清楚，使得臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療時(shí)的細(xì)胞數(shù)量及治療間隔無(wú)據(jù)可依。利用示蹤技術(shù)可以從受體中辨別移植的干細(xì)胞，并觀察其