臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植前細(xì)胞活性評價指標(biāo)的研究.pdf

1、背景：
　　人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcells,hUC-MSCs）憑借其組織來源廣泛、含量豐富、不受倫理限制等優(yōu)勢成為間充質(zhì)干細(xì)胞的理想來源,是目前干細(xì)胞移植的熱點(diǎn)。UC-MSCs作為一種動態(tài)的活細(xì)胞，移植前細(xì)胞活性對治療效果的影響最為直接。目前移植前細(xì)胞活性檢測指標(biāo)通常采用經(jīng)典臺盼藍(lán)染色法。但是由于易受主觀因素的影響，并且其檢測針對的是細(xì)胞膜完整性，

2、僅僅是細(xì)胞生理狀態(tài)的一部分，并不能時時地準(zhǔn)確反映細(xì)胞整體功能，從而影響對臨床應(yīng)用的指導(dǎo)意義。因此，探尋一種可準(zhǔn)確反映細(xì)胞功能狀態(tài)的活性指標(biāo)，將會大大促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床疾病治療、科學(xué)研究方面的發(fā)展。
　　目的：
　　通過對多種具有代表性的細(xì)胞活性測定方法進(jìn)行比較，探尋可準(zhǔn)確反映細(xì)胞功能狀態(tài)的活性指標(biāo)，篩選出一定條件下能夠真實(shí)反映移植前細(xì)胞狀態(tài)的活性指標(biāo)，為UC-MSCs臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.體

3、外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞免疫學(xué)表型鑒定，成骨成脂誘導(dǎo)；
　　2.UC-MSCs的保存：0.9％氯化鈉注射液，4℃條件下保存0h、2h、4h、6h；
　　3.評估人工活性測定方法（臺盼藍(lán)法、TUNEL、Live-DeadAssay、貼壁實(shí)驗(yàn)）的準(zhǔn)確性；
　　4.采用多種具有代表性的細(xì)胞活性測定方法（臺盼藍(lán)染色法、AnnexinV-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、貼壁實(shí)驗(yàn)）檢測保存后細(xì)

4、胞存活率；
　　5.對細(xì)胞存活率與反應(yīng)細(xì)胞功能狀態(tài)指標(biāo)CFE進(jìn)行相關(guān)性分析；
　　6.對貼壁實(shí)驗(yàn)在不同觀察者之間的可靠性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.針對0.9%生理鹽水保存不同時間點(diǎn)（0h、2h、4h、6h）的UC-MSCs進(jìn)行活性檢測，人工檢測方法（臺盼藍(lán)染色法、TUNEL、Live-DeadAssay、貼壁實(shí)驗(yàn)）之間最大測量差值大約分別是1.46%、6.89%、8.23%、8.94%，均小于10%的

5、統(tǒng)計(jì)誤差；
　　2.在UC-MSCs保存0h時，臺盼藍(lán)染色法同其它幾種經(jīng)典活性測定方法（AnnexinV-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、貼壁實(shí)驗(yàn)）比較，結(jié)果相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對于保存一定時間后UC-MSCs，細(xì)胞活力則具有顯著性差異；
　　3.觀察保存后細(xì)胞存活率與反應(yīng)其功能狀態(tài)指標(biāo)CFE之間的關(guān)聯(lián)程度，采用臺盼藍(lán)染色法測得的活細(xì)胞比例與CFE的相關(guān)性為r2=0.893，而其它的檢測方法

6、（AnnexinV-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、貼壁實(shí)驗(yàn)）測得的活細(xì)胞比例與CFE則具有較好的的相關(guān)性（分別為r2=0.935、0.949、0.924、0.947、0.982），其中貼壁實(shí)驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)最高；
　　4.貼壁實(shí)驗(yàn)作為一種人工活性檢測方法，其結(jié)果的可靠性存在爭議。采用其進(jìn)行活力分析時，5個觀察者測得的活性數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，具有較好的一致性。
　　結(jié)論：
　　1.采用幾種經(jīng)典