血管緊張素Ⅱ部分依賴Toll樣受體4介導(dǎo)心肌炎性反應(yīng)及隱丹參酮的干預(yù)作用研究.pdf

1、第一章 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞炎性因子表達的影響及隱丹參酮的干預(yù)作用
　　 目的：
　　 心室重構(gòu)是多種因素參與的復(fù)雜的病理生理過程，炎癥反應(yīng)與心室重構(gòu)關(guān)系密切，對其產(chǎn)生的機制及干預(yù)研究有助于心室重構(gòu)的轉(zhuǎn)歸。血管緊張素(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要效應(yīng)因子，循環(huán)和組織的AngⅡ濃度增高，可促進心肌細胞肥大和間質(zhì)纖維化，從而參與了心肌重構(gòu)的病理過程。除作為重要的生長因子外，AngⅡ可以調(diào)節(jié)細胞

2、因子、化學(xué)趨化因子和粘附分子等多種炎癥介質(zhì)的表達，作為炎癥前期的調(diào)節(jié)物質(zhì)參與機體炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實驗通過AngⅡ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)并觀察隱丹參酮的干預(yù)作用。
　　 方法：
　　 AngⅡ刺激體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞，采用倒置熒光顯微鏡檢測DHE熒光強度等方法反映細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 應(yīng)用免疫熒光法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位活化情況，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細胞上清中TNF

3、-α、IL-6的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.使用倒置熒光顯微鏡在正常情況下可以檢測到細胞內(nèi)的少量紅色熒光，100nMAngⅡ作用于細胞后，熒光明顯增強，2.5，5μM及10μM CTS預(yù)處理劑量依賴性抑制了AngⅡ的作用，10μM CTS組使熒光強度恢復(fù)接近正常水平。
　　 2、100nM AngⅡ及100ng/ml LPS作用于心肌細胞30min后NF-κB明顯入核，2.5、10μMCTS預(yù)處理劑量依賴

4、性的抑制了AngⅡ的作用。
　　 3、100nM AngⅡ作用24后，細胞上清中TNF-α、IL-6顯著增加，2.5、5、10μM CTS預(yù)處理劑量依賴性的抑制了AngⅡ的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、AngⅡ可誘導(dǎo)心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，隱丹參酮可減輕AngⅡ的作用。
　　 2、AngⅡ可誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，包括促進NF-κB入核，促進炎性因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生；
　　 3、隱丹參酮

5、劑量依賴性抑制AngⅡ促進NF-κB入核及促進炎性因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生的作用。
　　 第二章 TLR4在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌炎性反應(yīng)中的作用
　　 目的：
　　 Toll樣受體4(TLR4)是近期發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型跨膜受體，可介導(dǎo)多種病原體的識別和免疫活化過程，從而表達炎癥細胞因子和化學(xué)因子，但TLR4是否可以介導(dǎo)AngⅡ引起的心肌炎性反應(yīng)尚不清楚。因此，本章觀察了TLR4在AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細胞炎性反應(yīng)中的作用

6、。
　　 方法：
　　 采用RT-PCR和Western blot方法觀察了AngⅡ誘導(dǎo)TLR4表達的時效和量效關(guān)系；采用抗體阻斷及RNA干擾(RNAi)方法，觀察沉默TLR4基因后對AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的影響，探討TLR4與下游炎癥因子基因之間是否存在相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、AngⅡ上調(diào)心肌細胞TLR4 mRNA和蛋白表達具有劑量依賴性，在時效關(guān)系上，100nM An

7、gⅡ作用1h后TLR4 mRNA即顯著升高(與對照組比較，P＜0.01)，12h-24h維持高峰水平。100nM AngⅡ作用6h后TLR4蛋白顯著升高(與對照組比較，P＜0.01)，12-36h維持高峰水平，48h后表達逐漸下降。
　　 2、抗TLR4抗體(1ug/ml，5ug/ml)可以劑量依賴的抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌升高。
　　 3、三對Stealth siRNA都有抑制細胞TLR4的蛋白基礎(chǔ)表

8、達及AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4蛋白表達的效果，其中stealth(S1)的抑制作用最強。
　　 4、TLR4基因沉默顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌，100nM AngⅡ作用于心肌細胞24h后，TNF-α、IL-6水平分別增加約至對照組的3.1倍(p＜0.01)和3.3倍(p＜0.01)，S1轉(zhuǎn)染組使AngⅡ的效果分別降至對照組的1.5倍和1.7倍，與AngⅡ組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異；而陰性對照序列則沒有影響。
　

9、　 結(jié)論：
　　 1、AngⅡ誘導(dǎo)TLR4表達具有隨時間和劑量變化的趨勢。
　　 2、三對干擾序列中，stealth(S1)是最有效的抑制TLR4基礎(chǔ)表達的序列。
　　 3、TLR4在AngⅡ誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌中有重要作用。
　　 第三章 AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞TLR4表達的信號通路及分子機制
　　 目的：
　　 參與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)TLR4表達的信號通路與相關(guān)的轉(zhuǎn)

10、錄因子目前仍不太清楚。本研究探討AngⅡ誘導(dǎo)TLR4表達的分子機制，為尋找炎癥相關(guān)疾病的分子靶標提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 通過Western blot方法檢測ERK1/2磷酸化信號通路在AngⅡ作用下的激活；用RT-PCR和Western blot方法觀察了AT1 R的特異性阻斷劑Valsartan、ERK1/2上游激酶MEK1/2的特異性阻斷劑U0126、NAD(P)H氧化酶的抑制劑DPI及隱丹參酮預(yù)處理細胞

11、后AngⅡ?qū)LR4表達的影響。瞬時轉(zhuǎn)染和缺失分析尋找TLR4啟動子區(qū)潛在的AngⅡ效應(yīng)元件；凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)證實轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的特異性結(jié)合以及U0126對此作用的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、AngⅡ可以增加心肌細胞ERK1/2的磷酸化程度。
　　 2、100nM AngⅡ作用24h后，TLR4的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，而Valsartan、U0126和DPI預(yù)處理則可以減弱Ang

12、Ⅱ的作用(mRNA：Valsartan，-61％，P＜0.01；U0126，-49％，P＜0.01，DPI，-40％，P＜0.05；protein：Valsartan，-75％，P＜0.001；U0126，-42％，P＜0.01，DPI，-50％，P＜0.01)。
　　 3、TLR4啟動子-190～-52序列內(nèi)存在潛在的AngⅡ效應(yīng)元件。
　　 4、TLR4啟動子-146及-120位置分別存在轉(zhuǎn)錄因子AP-1和Ets的結(jié)