Toll樣受體介導(dǎo)角膜真菌感染炎癥反應(yīng)的作用及基因沉寂治療研究.pdf

1、第一部分: TLRs介導(dǎo)的角膜上皮細胞對煙曲霉菌的天然免疫反應(yīng)
　　 目的:研究角膜上皮細胞Toll樣受體(TLR)2和TLR4分別對配體刺激的免疫反應(yīng)及其介導(dǎo)角膜上皮細胞對煙曲霉菌炎癥反應(yīng)的作用。
　　 方法:培養(yǎng)永生化人角膜上皮細胞,利用TLR2配體酵母聚糖、TLR4配體LPS及煙曲霉菌菌絲分別刺激角膜上皮細胞,于不同時間點(1h,3k6k12h)收取培養(yǎng)上清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞因子IL-1β和

2、IL-6水平。分別設(shè)計靶向人TLR2、TLR4的siRNA序列,構(gòu)建表達TLR2.或TLR4-siRNA的質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染角膜上皮細胞,利用RT-PCR及Western blot檢測TLR2、TLR4表達以評價抑制效果。利用煙曲霉菌菌絲并分別刺激轉(zhuǎn)染siRNA的角膜上皮細胞及未轉(zhuǎn)染對照細胞,于不同時間點(1h,3h,6h,12h)利用ELISA檢測上清中細胞因子IL-1β和IL-6水平。
　　 結(jié)果:TLR2配體酵母聚糖、TLR4

3、配體LPS及煙曲霉菌均可刺激永生化人角膜上皮細胞(THCE)分泌炎性細胞因子IL-1β和IL-6。酵母聚糖刺激角膜上皮細胞后6h IL-1β和IL-6水平開始升高,并呈時間依賴性。LPS刺激后12h可見細胞因子顯著性升高,但表達水平不如酵母聚糖刺激明顯。煙曲霉菌刺激后3h細胞因子水平即明顯升高,隨刺激時間延長進一步上調(diào)。TLR2-或TLR4-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染角膜上皮細胞后,TLR2、TLR4 mRNA及蛋白水平表達均受到顯著抑制。煙曲

4、霉菌菌絲刺激后對照組IL-1β和IL-6表達明顯上調(diào),而TLR2-或TLR4-siRNA處理組IL-1β和IL-6水平均較對照組顯著降低。
　　 結(jié)論:TLR2配體和TLR4配體可誘導(dǎo)角膜上皮細胞的天然免疫反應(yīng)；角膜上皮細胞通過TLR2和TLR4識別煙曲霉菌并介導(dǎo)炎性細胞因子表達。角膜上皮細胞表達的TLR2和TLR4在角膜抗真菌感染天然免疫中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分:
　　 TLRs介導(dǎo)茄病鐮刀菌誘導(dǎo)的人角

5、膜基質(zhì)細胞抗炎細胞因子表達
　　 目的:研究TLR2在茄病鐮刀菌誘導(dǎo)的人角膜基質(zhì)細胞促炎細胞因子和抗炎細胞因子表達中的作用。
　　 方法:設(shè)計靶向人TLR2 siRNA序列,連接入p-silencer2.0 U6載體構(gòu)建能表達TLR2-siRNA的質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染永生化人角膜基質(zhì)細胞,利用免疫熒光、RT-PCR及Western blot檢測TLR2的表達。制備茄病鐮刀菌菌絲和孢子刺激液并分別刺激轉(zhuǎn)染siRNA的角膜基質(zhì)細胞

6、及未轉(zhuǎn)染對照細胞,刺激12h后利用實時熒光定量PCR檢測細胞因子IL-1β和IL-10的表達。
　　 結(jié)果:TLR2-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細胞后,TLR2 mRNA及蛋白水平表達均明顯被抑制,mRNA抑制效率為60％,蛋白抑制效率可達65％左右。對照siRNA轉(zhuǎn)染組、空載體組及空白對照組TLR2表達無顯著差異。單純鐮刀菌菌絲和孢子均可刺激人角膜基質(zhì)細胞IL-10和IL-1β表達明顯上調(diào),與對照組有顯著差異(P<0.01)

7、,其中菌絲刺激組細胞因子表達水平比孢子刺激組高。分別使用茄病鐮刀菌菌絲及孢子刺激后,對照組IL-1β及IL-10的表達均明顯上調(diào),且菌絲誘導(dǎo)的表達上調(diào)比孢子更顯著；RNA干擾組,IL-10表達較對照組明顯降低,菌絲刺激組IL-10表達下調(diào)82％,孢子刺激組下調(diào)70％,與未干擾組表達水平比較均具有顯著差異(P<0.01)；IL-1β的表達亦有降低,菌絲刺激組下調(diào)60％,孢子刺激組約下調(diào)54％,具有統(tǒng)計學(xué)差異,但不如IL-10下調(diào)顯著。

8、r>　　 結(jié)論:TLR2是人角膜基質(zhì)細胞識別茄病鐮刀菌的重要識別受體,它可能通過介導(dǎo)IL-10的表達發(fā)揮一種抗炎性作用。這將為探索角膜真菌感染發(fā)病機理和免疫防御反應(yīng)機制提供新的思路。
　　 第三部分:
　　 RNA干擾大鼠角膜TLR2表達對角膜真菌感染的影響
　　 目的:研究RNA干擾大鼠角膜TLR2對角膜煙曲霉菌感染的影響。
　　 方法:分別合成對照siRNA或TLR2siRNA,與轉(zhuǎn)染試劑混合制備s

9、iRNA懸液,于感染前1天給予結(jié)膜下注射聯(lián)合表面點眼。利用角膜接觸鏡法建立大鼠煙曲霉菌性角膜炎模型,進行裂隙燈檢查、臨床評分及組織病理學(xué)分析評價感染情況。利用免疫熒光技術(shù)檢測大鼠角膜TLR2表達以評價TLR2 siRNA轉(zhuǎn)染的效率。利用實時定量PCR技術(shù)檢測炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-4,IL-6,IL12p40和趨化因子MCP-1和MIP-2表達水平。利用髓過氧化物酶(MPO)法檢測多型核白細胞(PMN)浸潤。
　　

10、 結(jié)果:ILR2 siRNA轉(zhuǎn)染后,大鼠角膜TLR2表達明顯減少,呈區(qū)域性、節(jié)段性分布。對照siRNA轉(zhuǎn)染組角膜TLR2呈正常表達。對照組大鼠角膜給予煙曲霉菌接種后,角膜炎呈進行性發(fā)展,第1天可見角膜上皮呈毛玻璃樣水腫,第3天可見明顯的黃白色潰瘍,邊界不清,角膜緣充血明顯；病變發(fā)展迅速,第4-5天為感染高峰期,潰瘍面進一步擴大,表面凹凸不平,角膜中央?yún)^(qū)壞死組織脫落呈典型的龕狀潰瘍,可見后彈力層膨出、角膜葡萄腫甚至角膜穿孔。轉(zhuǎn)染組感染后

11、第1天角膜見輕度炎性浸潤,第3天角膜浸潤較前加重,但未見明顯潰瘍,第5天浸潤開始減輕,面積逐漸局限、縮小,于2周左右完全愈合,僅存小片云翳及新生血管。對照組大鼠角膜炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-4,IL-6,IL12p40及趨化因子MCP-1、MIP-2表達水平在第1天開始上調(diào),于3-5天達到高峰,第7天開始下降并于2周后恢復(fù)至低水平。相比之下,TLR2 siRNA轉(zhuǎn)染組炎性細胞因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL12p4

12、0及趨化因子MCP-1、MIP-2水平明顯降低,IL-4水平未見顯著下調(diào)。TLR2 siRNA轉(zhuǎn)染組PMN浸潤較對照組明顯減輕。
　　 結(jié)論:siRNA可通過結(jié)膜下注射聯(lián)合點眼的方式成功轉(zhuǎn)入角膜組織。TLR2是角膜識別煙曲霉菌感染的主要受體,在誘導(dǎo)炎性細胞因子產(chǎn)生和炎性浸潤發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR2siRNA可通過下調(diào)炎性細胞因子及炎性細胞浸潤達到抑制角膜過度炎癥反應(yīng)和減少角膜損傷的目的,為探索利用TLR2基因沉寂治療角膜真菌感染的