Toll樣受體7在HBV感染中作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV)感染是一個(gè)全球性健康問題。部分人初次感染HBV后不能徹底清除病毒，成為慢性HBV攜帶者或慢性乙型肝炎患者，甚至發(fā)展為肝硬化，肝癌而嚴(yán)重危害人類健康。HBV持續(xù)感染與宿主的特異性免疫耐受、干擾素α產(chǎn)生水平低下，T細(xì)胞應(yīng)答不足或漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞減少及功能受損等現(xiàn)象相關(guān)，但其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。
　　 Toll樣受體（TLR)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類

2、模式識(shí)別受體，通過對(duì)病原體相關(guān)分子模式（PAMP)的識(shí)別，在天然免疫和獲得性免疫中起著重要橋梁的作用[1]。TLR7是TLR家族的重要成員之一，與其配體結(jié)合可以誘導(dǎo)干擾素、白介素和腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用[2,3]。TLR7的激動(dòng)劑咪喹莫特（IMQ/R-847））和艾沙托立賓（Loxribine的同類物），已分別用于皮膚癌和慢性丙型肝炎的治療[4,5]。TLR7的另一配體Resiquimod(R-848)可以通過誘導(dǎo)

3、IFN-α，IFN-β的產(chǎn)生顯著抑制HBV的復(fù)制[2]。TLR7在抗病毒免疫作用中必不可少，而在慢性乙型肝炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR7表達(dá)顯著降低[6]。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于HBV感染對(duì)TLR7表達(dá)調(diào)控影響的研究甚少，TLR7在乙型病毒性肝炎發(fā)病中的作用及機(jī)理尚不確定。
　　 本研究通過對(duì)TLR7介導(dǎo)的體外抗HBV作用和HBV轉(zhuǎn)染對(duì)TLR7表達(dá)調(diào)控影響的研究，闡述TLR7在乙型病毒性肝炎發(fā)病中的作用。通過檢測(cè)TLR7介導(dǎo)的慢

4、性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，IL-12含量的改變，探討慢性HBV感染對(duì)免疫細(xì)胞TLR7功能的損傷及意義，闡述TLR7在慢性HBV感染中的作用及可能的機(jī)制，以期為TLRs介導(dǎo)的固有免疫的研究提供參考資料，為尋找治療乙肝的新靶點(diǎn)和新藥的開發(fā)提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.通過TLR7特異性配體Loxoribine刺激HepG2.2.15細(xì)胞株的研究，探討TLR7介導(dǎo)的體外抗HBV作用及機(jī)制。

5、r>　　 2.通過檢測(cè)TLR7特異性配體Loxoribine刺激HBV轉(zhuǎn)染前后的HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞株TLR7的表達(dá)，探討HBV轉(zhuǎn)染對(duì)TLR7表達(dá)及調(diào)控的影響，闡述TLR7在乙型病毒性肝炎發(fā)病中的作用。
　　 3.通過檢測(cè)TLR7介導(dǎo)的慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，IL-12含量的改變，探討慢性HBV感染對(duì)免疫細(xì)胞TLR7功能的損傷及意義，闡述TLR7在慢性HBV感染中作用及機(jī)制。
　　

6、研究方法：
　　 1.選用能穩(wěn)定分泌HBV顆粒和HBV抗原標(biāo)志物的HepG2.2.15細(xì)胞株為HBV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型，應(yīng)用ELISA及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TLR7特異性配體Loxoribine 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg，HBeAg分泌和HBV DNA復(fù)制的抑制作用，探討TLR7介導(dǎo)的體外抗HBV作用。
　　 2.MTT比色法檢測(cè)TLR7特異性配體Loxoribine刺激對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用

7、。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2，HepG2.2.15細(xì)胞株胞內(nèi)TLR7蛋白的表達(dá)水平，及特異性配體Loxoribine誘導(dǎo)對(duì)其表達(dá)調(diào)控的影響。
　　 4.ELISA法檢測(cè)TLR7特異性配體Loxoribine刺激慢性HBV感染患者和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，IL-12含量的改變，評(píng)價(jià)慢性HBV感染對(duì)免疫細(xì)胞TLR7功能的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.在TLR7特異性配體Loxor

8、ibine作用下,可有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌及HBV DNA的復(fù)制，對(duì)HBsAg分泌的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。對(duì)HBeAg的分泌無抑制作用。
　　 2.低濃度Loxoribine對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長有一定抑制作用，但隨著配體濃度增高，對(duì)細(xì)胞生長無明顯毒性作用。
　　 3.HepG2和 HepG2.2.15細(xì)胞胞內(nèi)均有TLR7表達(dá)，但轉(zhuǎn)染了HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞胞內(nèi)T

9、LR7的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。TLR7特異性配體Loxoribine誘導(dǎo)后HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞胞內(nèi)TLR7表達(dá)量均有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.乙肝病毒攜帶組及慢性乙肝患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α水平明顯低于健康對(duì)照組；慢性乙肝患者組IL-12水平明顯高于健康對(duì)照組；乙肝病毒攜帶組和慢性乙肝患者組間，PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-α和IL-12水平無明顯差異。
　　

10、 5.TLR7特異性配體Loxoribine刺激培養(yǎng)后，健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α，IL-12水平顯著升高，乙肝病毒攜帶組及慢性乙肝患者組IFN-α，IL-12水平亦均有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.特異性配體Loxoribine有較顯著的抗HBV作用，其對(duì)HBV的抑制可能是TLR7介導(dǎo)作用于病毒復(fù)制及蛋白合成等環(huán)節(jié)。
　　 2.HBV感染抑制了TLR7的表達(dá)，特異性配