辣椒素和阿托他汀對心肌重構(gòu)的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 近年來心力衰竭的治療取得了一定的進(jìn)展，但其發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)仍然居高不下。因此，探討好的治療方法及研制新的藥物是醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。心力衰竭是一組臨床上極為常見的心血管綜合征，冠心病、高血壓、心肌梗塞、心律失常、瓣膜異常都可引起心力衰竭。心衰時對心臟構(gòu)和功能的研究經(jīng)歷了相當(dāng)長的時期，直到20試劑90年代才意識到心衰發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)是心室重構(gòu)，心室重構(gòu)是心衰患者發(fā)病率和死亡率的決定因素。心室重構(gòu)是指心

2、臟受到損傷后基因表達(dá)、分子、細(xì)胞和心肌間質(zhì)的變化，臨床表現(xiàn)為心臟大小、形狀和功能的改變。心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)主要包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、炎性細(xì)胞因子系統(tǒng)、機(jī)械應(yīng)激、氧化應(yīng)激、高鹽、高糖、轉(zhuǎn)化生長因子等都能在一定程度上影響心室重構(gòu)的進(jìn)行。
　　 心臟通過能量代謝將儲存于脂肪酸或葡萄糖中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，為心臟收縮和舒張?zhí)峁┠芰俊４x底物從脂肪酸到葡萄糖利用的適應(yīng)性轉(zhuǎn)換在心肌重構(gòu)的病理生理過程中起到關(guān)鍵性作用。糖脂代謝異?？?/p>

3、通過影響心肌能量代謝，促使心肌代謝重構(gòu)。鹽是高血壓、心肌肥厚重要的環(huán)境因素，鹽代謝異?？赏ㄟ^增加氧化應(yīng)激，促使心肌重構(gòu)。本研究從脂質(zhì)，高鹽兩個方面對心肌重構(gòu)進(jìn)行探討。
　　 過氧化物酶增殖體激活受體γ共活化因子-1(PGC-lα)在高代謝率的組織表達(dá)較高，例如心臟，肌肉和棕色脂肪組織。PGC-1α和核受體家族或是非核受體家族相互作用，來調(diào)控不同的細(xì)胞能量代謝通路，在心肌肥厚和心衰的進(jìn)展中PGC-1α起著重要的作用。例如，PGC-

4、1α和雌激素相關(guān)受體作用，來調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶4(PDK4)，通過對PDK4的調(diào)控，從而完成對葡萄糖氧化的調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)報(bào)道，在心肌肥厚的發(fā)展中，心肌對葡萄糖的利用增加，PGC-1α和PDK4的蛋白表達(dá)受到抑制，都是其特征性的表現(xiàn)。UCP2在心肌中大量表達(dá)，減少ROS產(chǎn)生和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，iNOS表達(dá)上調(diào)可增加心肌纖維化、心肌硝基化和啟動心肌重構(gòu)等。PPARδ可激活UCP2、減少iNOS表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激，改善心肌重構(gòu)。
　　 他汀

5、類藥物(HMG-CoA還原酶抑制劑)是臨床上廣泛應(yīng)用的降脂藥物，人們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物產(chǎn)生的獲益遠(yuǎn)大于降脂作用本身善內(nèi)皮功能現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的作用包括改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊、改善凝血功能、減少神經(jīng)內(nèi)分泌激活、刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、減少骨質(zhì)吸收及抗腫瘤等多效性。鹽是高血壓，心肌肥厚重要的環(huán)境因素，鹽的攝入與高血壓患病率呈明顯的量效關(guān)系，我國心血管病的發(fā)病率率呈北高男低的特點(diǎn)。而我國南北方飲食有顯著差異，北方喜食高鹽

6、，云、貴、川居民喜食辣椒食品，已報(bào)道辣椒素能調(diào)節(jié)高鹽誘導(dǎo)血壓升高?；谝陨媳尘?，我們提出如下科學(xué)假說：阿托伐他汀是否能夠通過對PGC-1α的調(diào)節(jié)，而改善炎性狀態(tài)下的心肌的糖脂代謝紊亂，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)？辣椒素激活TRPV1調(diào)節(jié)高鹽誘導(dǎo)的血壓的同時，是否能改善高鹽誘導(dǎo)心肌重構(gòu)？
　　 材料與方法：
　　 第一部分：胚胎來源的大鼠心肌細(xì)胞系H9c2，在DMEM培養(yǎng)基(10％的胎牛血清)中生長，種植的密度維持在5，000 cell

7、s/cm2，培養(yǎng)基每兩天更換一次，細(xì)胞在5%CO2 and95% O2條件下生長。待近于融合時，更換成無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。細(xì)胞分組有H9c2 cells，H9c2+TNF-α，H9c2+TNF-α+Atorvastatin，siPGC-1α分別進(jìn)行了研究。第二部分：采用離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。在體實(shí)驗(yàn)C57BL/6J野生型(WT)和TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠作為研究對象進(jìn)行飲食干預(yù)，離體實(shí)驗(yàn)以辣椒素刺激心肌細(xì)胞

8、為研究對象。WT和TRPV1-/-小鼠隨機(jī)分為普食組(NS組)，高鹽組(HS)，高鹽加辣椒素組(HS+Cap)干預(yù)1年，從2月齡開始。
　　 1.心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)，用TNF-α刺激，同時用阿托伐他汀干預(yù)細(xì)胞我們檢測以上各組的葡萄糖氧化率。
　　 2.心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)，用TNF-α刺激，同時用不同濃度的阿托伐他汀干預(yù)細(xì)胞1-25μmol/L持續(xù)24小時，后收集細(xì)胞提蛋白行western檢測PGC-1α的抗體。同時給

9、予甲羥戊酸，金合歡醇，龍牛兒基龍牛兒醇等觀察阿托伐他汀對所起的作用和這幾種物質(zhì)的關(guān)系。
　　 3.細(xì)胞分組有H9c2 cells，H9c2+TNF-α，H9c2+TNF-α+Atorvastatin，干預(yù)結(jié)束后，提蛋白行western檢測PDK4和CPT1
　　 4.用RNA干擾技術(shù)，敲減PGC-1α后檢測心肌細(xì)胞中PDK4和CPT1的蛋白表達(dá)情況，
　　 5.心肌細(xì)胞分組control，GFP+TNF-α，si

10、PGC-1α+TNF-α，然后檢測各組的葡萄糖的氧化率。
　　 6.用蛋白免疫印跡檢測TRPV1蛋白的表達(dá)；用免疫熒光染色觀察TRPV1在H9C2心肌細(xì)胞的具體分布。
　　 7.比率熒光成像系統(tǒng)檢測辣椒素刺激下H9C2心肌細(xì)胞[Ca2+]i的變化，觀察TRPV1特異性拮抗劑iRTX對鈣信號變化的影響。
　　 8.用超聲評價各組小鼠的心功能。
　　 9.檢測各組小鼠的心臟重量/體重，應(yīng)用Masson染色檢測

11、膠原沉積，DHE染色檢測超氧陰離子水平，組織切片HE染色觀察肥厚指標(biāo)。
　　 10.檢測心臟組織的蛋白表達(dá)PPAR-δ，inos，ucp2。
　　 11.檢測心肌細(xì)胞PPAR-δ蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞葡萄糖氧化率顯著增加，而用阿托伐他汀共培養(yǎng)后顯著抑制了這種增加。
　　 2.阿托伐他汀對抗TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PGC-1α的下調(diào)，并呈計(jì)量依賴性的，但這種下調(diào)和

12、甲羥戊酸，金合歡醇有關(guān)，而與龍牛兒基龍牛兒醇無關(guān)。
　　 3.TNF-α刺激心肌細(xì)胞后，會使PGC-1α，PDK4，CPT1顯著下調(diào)，而阿托伐他汀能逆轉(zhuǎn)TNF-α的這種效果。
　　 4.在心肌細(xì)胞中敲減PGC-1α，而PGC-1α的靶基因PDK4，CPT1顯著下調(diào)。
　　 5.在心肌細(xì)胞中敲減PGC-1α，使得葡萄糖氧化率顯著升高。
　　 6.TRPV1在H9C2心肌細(xì)胞和小鼠心肌組織均有表達(dá)。
　

13、　 7.辣椒素刺激H9C2心肌細(xì)胞引起濃度依賴性的[Ca2+]i升高，TRPV1特異性拮抗劑iRTX預(yù)處理可抑制這種細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化。
　　 8.高鹽飲食誘導(dǎo)使心功能惡化，辣椒素能改善高鹽誘導(dǎo)的心功能。而在TRPV1-/-小鼠沒有觀察到這種效果。
　　 9.長期高鹽飲食誘導(dǎo)使心肌肥厚和纖維化，而辣椒素能改善高鹽誘導(dǎo)的肥厚，纖維化。
　　 10.辣椒素能上調(diào)高鹽誘導(dǎo)后心肌組織中的PPAR8，UCP2蛋白表達(dá)，而

14、減少iNOS的表達(dá)。
　　 11.辣椒素能上調(diào)心肌細(xì)胞中PPARδ的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞葡萄糖氧化率顯著增加，而阿托伐他汀對抗了這種增加。而且相應(yīng)的蛋白表達(dá)發(fā)生了改變，TNF-α刺激導(dǎo)致了PGC-1α，PDK4 and CPT1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，阿托伐他汀同時也逆轉(zhuǎn)了這些蛋白的下調(diào)，同時阿托伐他汀對抗PGC-1α的下調(diào)呈濃度依賴性的。
　　 2.在心肌細(xì)胞中我們應(yīng)用

15、滿病毒系統(tǒng)，敲減PGC-1α，同時檢測了PGC-1α相關(guān)的蛋白PDK4，CPT1顯著下調(diào)。而心肌細(xì)胞的葡萄糖的氧化率也在PGC-1α，敲減后，顯著的增加。
　　 3.阿托伐他汀對抗炎癥狀態(tài)下心肌細(xì)胞葡萄糖氧化率的增加和PGC-1α上調(diào)有關(guān)，這些變化可能和類異戊烯的代謝物有關(guān)。
　　 4.辣椒素激活TRPV1能減輕高鹽攝入誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少超氧陰離子產(chǎn)生，改善高鹽膳食導(dǎo)致的心功能的損傷，減輕高鹽攝入導(dǎo)致的心肌肥厚。