珙桐FCA與FT基因的克隆及表達(dá).pdf

1、珙桐（Davidia involucrata Baill.）又名鴿子樹，是第三紀(jì)古熱帶植物孑遺種，具有很高的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和科研價(jià)值。珙桐對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，成熟幼苗的繁殖率低，珙桐屬多年生喬木，有性生殖世代周期長(zhǎng)，開花研究十分重要。FCA(Floweringcontrol locus a)基因和FT(Flowering Locus T)基因分別是開花植物自主途徑和光周期途徑中的重要的調(diào)控基因。本實(shí)驗(yàn)利用得到的珙桐種子轉(zhuǎn)錄組基因庫片

2、段基因，進(jìn)行同源比對(duì)克隆、RACE等方法獲得珙桐的FCA基因全長(zhǎng)序列以及FT部分序列，并通過qRT-PCR分析珙桐FCA和FT的表達(dá)模式，為后續(xù)的開花基因功能和轉(zhuǎn)基因開花機(jī)理研究提供了一定幫助，由于珙桐材料難以獲得，本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)珙桐材料的獲取中，做了一定量的組培實(shí)驗(yàn)，以保證后期能夠做更多的實(shí)驗(yàn)拓展。本研究獲得了如下結(jié)果:
　　1、珙桐組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的建立
　　取飽滿、剛結(jié)出的果實(shí)，采取100％酒精灼燒滅菌，取帶胚乳的

3、種胚，接種于不加激素的WPM基本培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)一定時(shí)間后去掉外胚乳，能夠完整、快速的生長(zhǎng)。珙桐在組培培養(yǎng)基上褐化程度較高，導(dǎo)致珙桐組培成活率低，用根、莖、葉等培養(yǎng)愈傷組織較難。本研究打破珙桐種子的自然休眠期，避免了組織培養(yǎng)中根、莖、葉等再生困難、生根率低成本高等一系列問題，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料的獲取以及轉(zhuǎn)基因組培苗建立了簡(jiǎn)單快速繁殖的方法。
　　2、珙桐FCA及FT基因的克隆
　　利用RACE及普通PCR技術(shù)克隆獲得了珙桐DiFC

4、A（Davidia involucrata FCA）完整ORF序列1596bp，并能編碼的保守功能結(jié)構(gòu)域（RRM2、WW-蛋白互作），編碼531個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析DiFCA基因?yàn)殓钔〧CA家族中轉(zhuǎn)錄前調(diào)控的一種，且該蛋白為親水蛋白，并預(yù)測(cè)該蛋白主要位于細(xì)胞核和微體中。并克隆出了珙桐DiFT（Davidia involucrata FT）部分ORF序列321bp，分析其具有PEBP家族保守結(jié)構(gòu)D-P-D-A-P，第86位H-(組氨酸

5、殘基)，以及底物結(jié)合位點(diǎn)86位的H-和FT亞家族保守位點(diǎn)84位的Y-（絡(luò)氨酸殘基），推測(cè)其屬于珙桐FT基因。
　　3、DiFCA和DiFT基因的表達(dá)分析
　　熒光定量PCR分析DiFT與DiFCA基因表明:
　　1)開花起始時(shí)期的珙桐樹中，DiFCA在花芽組織（花器官）中表達(dá)最多，在大、小苞片中表達(dá)較多，老葉中次之，嫩葉中表達(dá)最少;DiFT在老葉中遠(yuǎn)高于其他組織，嫩葉中最少。
　　2)在同一棵樹開花周期內(nèi)，DiF

6、CA與DiFT隨著開花過程的進(jìn)行具有相同的趨勢(shì)，隨著開花的周期的變化，先上升后下降，但DiFT的表達(dá)峰值較早于DiFCA。DiFCA基因在花序的表達(dá)量略高于在葉片中的表達(dá)量;而DiFT基因在老葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于花序中的表達(dá)量;在同一葉片組織中，隨開花周期的進(jìn)行，自主途徑DiFCA表達(dá)量的峰值與珙桐開花盛開程度基本成符合，DiFT的表達(dá)量峰值略早于開花茂盛程度的高峰期，反應(yīng)了光周期途徑的敏感性。
　　3)開花周期起始日，在不同的海拔

7、高度的珙桐樹:珙桐樹在900-1300米內(nèi)，隨著海拔的升高，DiFCA的表達(dá)量逐漸下降，DiFT的表達(dá)量則先上升后下降，開花起始日(4月27)在900米為最適開花環(huán)境，越往上走則開花狀態(tài)延遲。在低海拔地區(qū)（不開花珙桐）DiFCA的表達(dá)量較低，但未檢測(cè)出DiFT的表達(dá)。
　　4)在一年生的珙桐組培苗定量中:在下胚軸和頂芽中存在較微量的DiFCA基因的表達(dá)，而DiFT則未檢測(cè)出表達(dá);在假子葉、真葉中均未檢測(cè)出DiFCA和DiFT的表達(dá)