蒙古鲌ob基因克隆及表達(dá).pdf

1、該文中的試驗(yàn)魚——蒙古鮊購(gòu)自南湖漁場(chǎng)，健康無病，雄魚體長(zhǎng)23.1cm，體重151.3g；雌魚體長(zhǎng)為25.2cm，體重155.6g。根據(jù)已知的人和鼠ob基因序列設(shè)計(jì)引物，引物中分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，通過RT-PCR從蒙古鮊脂肪組織RNA中擴(kuò)增到ob基因片段。將此片段與pBluescripSK(+)載體同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳回收各自片段后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG、X-gal和

2、Amp+的瓊脂糖平板，挑取乳白色的菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆命名為pSK-ob，將此質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序，首次獲得蒙古鮊ob基因編碼區(qū)438bp的序列。ob基因序列在不同物種之間具有很高的保守性。將此序列與人、鼠和豬的ob基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)蒙古鮊與人、鼠和豬ob基因核苷酸編碼序列的同源性分別為82％、84％和99％；蒙古鮊ob基因編碼的蛋白leptin氨基酸序列與人、鼠和豬leptin蛋白氨基酸同源性分別為80.

3、8％、78.8％和95.2％。定量取蒙古鮊不同組織0.2g，提取其總RNA后，用半定量RT-PCR技術(shù)分析組織ob基因表達(dá)特異性，結(jié)果表明：ob基因在脂肪和肝臟組織中表達(dá)量最大，在心臟、脾臟、肌肉、腦、卵巢中表達(dá)量次之，在腎臟中表達(dá)很少，而在精巢和腸道組織中不表達(dá)。將含ob基因的克隆載體pSK-ob與表達(dá)載體pET-28a同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，回收所需片段連接并轉(zhuǎn)化后，涂布于含IPTG、X-gal和Kan+的瓊脂糖平板，挑