六味地黃丸對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病的預(yù)防作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、該課題采用了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型之一OLETF(OtsukaLong-EvansTokushimaFatty)鼠進(jìn)行六味地黃丸預(yù)防糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病率的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制-β細(xì)胞凋亡和胰島素抵抗的影響進(jìn)行初步探討，為中醫(yī)藥預(yù)防糖尿病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病的預(yù)防作用 [目的] 通過(guò)觀察六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型

2、OLETF鼠糖尿病發(fā)病的影響，探討六味地黃丸對(duì)2型糖尿病的預(yù)防作用，為六味地黃丸預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生尋找動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法] 1.以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO(Long-EvansTokushimaOtsuka)鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。大鼠皆為雄性，共分三組。OLETF鼠干預(yù)組(干預(yù)組)和OLETF鼠對(duì)照組(對(duì)照組)，每組20只；LETO鼠10只作為正常對(duì)照組(LETO組)。從8周齡開

3、始，干預(yù)組予六味地黃丸溶液灌胃(2.4g·kg-1d-1)，其余兩組以等量蒸餾水灌胃。 2.定期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，監(jiān)測(cè)血糖。試驗(yàn)前隔夜禁食15小時(shí)、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃。于空腹及糖負(fù)荷后30、60、90和120min剪尾法取血，以強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定血糖值。血糖峰值＞16.7mmol/L和負(fù)荷后120min血糖＞11.1mmol/L診為糖尿病，具備上述一條者為糖耐量減低。 3.監(jiān)測(cè)各組

4、大鼠攝食及體重增長(zhǎng)情況，每周稱量大鼠體重和攝食量。于8周齡、32周齡和40周齡分批宰殺大鼠。檢測(cè)血糖、血清甘油三脂、血清膽固醇、血清游離脂肪酸、血漿胰島素。 [結(jié)果] 1.對(duì)照組和干預(yù)組OLETF鼠攝食量一直顯著高于LETO組(p＜0.01)。干預(yù)組與對(duì)照組攝食量在各周齡均無(wú)顯著差異(p＞0.05)。對(duì)照組和干預(yù)組OLETF鼠體重從第6周齡開始顯著高于LETO組(p＜0.05)，并一直持續(xù)至40周齡實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組和干預(yù)

5、組之間各周齡體重均無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 2.對(duì)照組負(fù)荷后2h血糖(2hPG)23周齡明顯升高(10.1±1.8mmol/L)，干預(yù)組2hPG30周齡時(shí)出現(xiàn)明顯升高(9.4±2.3mmol/L)。40周齡，干預(yù)組2hPG顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)，葡萄糖曲線下面積(AUC)亦顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)。干預(yù)組和對(duì)照組在40周齡時(shí)AUC均顯著高于LETO組。 3.對(duì)照組在23周齡始發(fā)生糖尿病，發(fā)病率隨周齡延長(zhǎng)

6、而升高，40周齡發(fā)病率達(dá)92.9％。干預(yù)組30周齡出現(xiàn)第一例糖尿病，40周齡時(shí)發(fā)病率為28.6％，顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)。LETO組無(wú)糖尿病或糖耐量異常(IGT)發(fā)生。 4.干預(yù)組血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)。 [結(jié)論] 1.六味地黃丸能夠顯著降低OLETF鼠血糖升高程度，延緩高血糖的出現(xiàn)。 2.六味地黃丸可顯著降低OLETF鼠2型糖尿病的發(fā)病率，

7、有效預(yù)防糖尿病的發(fā)生，而且這種預(yù)防作用與大鼠體重的降低無(wú)關(guān)。 3.六味地黃丸能夠顯著降低血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素水平。 第二部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響 [目的] 通過(guò)觀察六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡水平及其凋亡相關(guān)因素的影響，對(duì)六味地黃丸抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用和可能機(jī)制進(jìn)行初步探討，為六味地黃丸預(yù)防糖尿病的作用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [

8、方法] 1.分別于8、32和40周齡隨機(jī)處死大鼠。大鼠宰殺后分離胰腺，濾紙吸干水份稱重。縱向分離并分別置于4％多聚甲醛、液氮和3％戊二醛中待檢。 2.通過(guò)HE染色和免疫組化法觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)改變。相鄰切片分別用HE染色觀察組織學(xué)改變、用免疫組化標(biāo)記胰島β細(xì)胞、TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)。 3.胰腺石蠟切片免疫組化技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，觀察其在各組大鼠胰腺中表達(dá)量的變化。 4

9、.液氮內(nèi)存放的胰腺組織提取總RNA，以半定量RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax，觀察其在基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差別。 5.透射電子顯微鏡觀察胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 [結(jié)果] 1.各組大鼠胰腺重量隨周齡延長(zhǎng)有逐漸增加的趨勢(shì)。但不同周齡大鼠自身比較及相同周齡各組大鼠間胰腺重量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各組8周齡和32周齡胰腺/體重％無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，40周齡LETO組顯著高于干預(yù)組和

10、對(duì)照組(p＜0.01)。 2.32周齡，對(duì)照組大鼠胰島纖維化嚴(yán)重，腺泡與胰島散在交錯(cuò)；40周齡時(shí)，胰島纖維組織增生嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)明顯胰島萎縮。干預(yù)組大鼠多數(shù)胰島仍保留基本形態(tài)。 3.各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率隨周齡延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。對(duì)照組胰島β細(xì)胞凋亡率8周齡時(shí)即高于同周齡LETO組，32周齡始具有顯著性(p＜0.01)。干預(yù)組胰島β細(xì)胞凋亡水平32周齡顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)。

11、 4.干預(yù)組Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率在40周齡顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，Bcl-2mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(p＜0.01)，BaxmRNA表達(dá)則較對(duì)照組下降(p＜0.01)。5電鏡下可見(jiàn)胰島β細(xì)胞呈典型凋亡改變。干預(yù)組胰島β細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞器腫脹。 [結(jié)論] 1.六味地黃丸有助于保持OLETF鼠胰島的正常結(jié)構(gòu)。 2.六味地黃丸可顯著降低OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡水平。 3.六味地黃丸能改變凋亡相關(guān)

12、基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，使凋亡抑制基因表達(dá)升高，凋亡促進(jìn)基因表達(dá)下降。 第三部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島素抵抗的影響 [目的] 通過(guò)六味地黃丸的早期干預(yù)，研究其對(duì)OLETF鼠胰島素抵抗的影響；同時(shí)觀察六味地黃丸對(duì)OLETF鼠血漿脂聯(lián)素水平、脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量以及胰島素敏感性相關(guān)指標(biāo)的影響，為該藥預(yù)防和治療糖尿病提供理論依據(jù)。 [方法] 1.分別于8、32和40周齡時(shí)隨機(jī)處

13、死大鼠，采血檢測(cè)空腹血清葡萄糖、游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇、血漿胰島素和脂聯(lián)素水平。 2.取大網(wǎng)膜、附睪脂肪和腎周脂肪組織稱重，計(jì)算內(nèi)臟脂肪重量，并計(jì)算體脂比。 3.采用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平。 4.計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。 5.分析血漿脂聯(lián)素水平與各相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。 [結(jié)果] 1.與LETO組相比，對(duì)照組除空腹血糖升高不顯著外，大鼠體重、脂肪

14、含量、體脂比、空腹血漿胰島素、血清甘油三酯、膽固醇均顯著升高，胰島素敏感指數(shù)顯著降低。 2.對(duì)照組血漿脂聯(lián)素水平和脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量與LETO組相比顯著降低。 3.干預(yù)組空腹血糖與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，但空腹胰島素和血清甘油三酯、膽固醇均顯著降低，胰島素敏感指數(shù)顯著增高。 4.與對(duì)照組相比，干預(yù)組的血漿脂聯(lián)素水平和脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量均明顯增加。 5.對(duì)照組血漿脂聯(lián)素與胰島素敏感指數(shù)呈正