鑒定直腸癌異常表達(dá)的miRNAs及其與惡性演進(jìn)的關(guān)系.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是我國(guó)最常見的癌癥之一，結(jié)直腸癌篩查與早期診斷是降低疾病死亡率的關(guān)鍵，因此，尋找結(jié)直腸癌癌變相關(guān)的生物標(biāo)志物(Biomarker)具有重要的臨床意義。越來越多的證據(jù)表明微小RNA(microRNA，miRNA)異常表達(dá)與癌變密切相關(guān)，miRNA可能是一類重要的腫瘤生物標(biāo)志物；miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼RNA，約由22-25個(gè)核苷酸組成。它在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期與細(xì)胞

2、凋亡的調(diào)控、癌變等多個(gè)方面起重要的作用。miRNA通過5’端第2～8核苷酸與mRNA3’端非翻譯區(qū)部分序列的結(jié)合，促使靶mRNA的降解和翻譯抑制。miRNA起著類似轉(zhuǎn)錄因子的功能，調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA異常表達(dá)是癌變過程中的關(guān)鍵因素之一。鑒定腫瘤異常表達(dá)的miRNA將增進(jìn)我們對(duì)癌變分子機(jī)理的理解，同時(shí)，也可為癌癥篩查、早期診斷與預(yù)后提供非常有用的分子標(biāo)志物。
　　 已有一些研究表明：在結(jié)直腸癌中miRNA也呈現(xiàn)異常下調(diào)或上

3、調(diào)表達(dá)。采用實(shí)時(shí)RT-PCR方法鑒定了13個(gè)在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)的miRNA；采用包含287個(gè)miRNA的芯片分析結(jié)直腸癌與直腸癌細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜，確定了37個(gè)與正常組織表達(dá)有明顯差異的miRNA；采用包含455個(gè)miRNA的基因芯片發(fā)現(xiàn)了21個(gè)miRNA在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)。據(jù)估計(jì)，人存在大約1000個(gè)miRNA，在結(jié)直腸癌中，已有的研究報(bào)告分別篩選了96、145、287及455個(gè)miRNA的異常表達(dá)，因此，完全有必要

4、系統(tǒng)地鑒定在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的miRNA。
　　 近年來的研究表明：結(jié)直腸癌應(yīng)被視為一種“復(fù)雜的”、異質(zhì)性疾病。結(jié)直腸癌發(fā)生在近端和遠(yuǎn)端表現(xiàn)出不同的生物學(xué)與臨床特征。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10多個(gè)腫瘤相關(guān)標(biāo)志物在近端和遠(yuǎn)端發(fā)生的結(jié)直腸癌間呈現(xiàn)明顯的差異。同樣，根據(jù)腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定來區(qū)分右側(cè)結(jié)腸癌與直腸癌；E-cadherin表達(dá)差異來區(qū)分左側(cè)結(jié)腸癌和直腸癌。連同在胚胎發(fā)育過程中整個(gè)結(jié)直腸不同區(qū)域起源和基因表達(dá)譜差異方面的證據(jù)，顯示結(jié)直腸癌是

5、包含不同疾病的“復(fù)雜病”。已有的研究混合了結(jié)腸癌與直腸癌樣本，同時(shí)，沒有區(qū)分不同的病理分期，因此，采用基因芯片分析就造成許多本來異常表達(dá)的miHA被忽略。
　　 為解決以上這些問題，我們使用包含了904個(gè)miRNA的新一代基因芯片(已接近人類所有的miRNA)來確定直腸癌和非瘤組織中差異表達(dá)的miRNA。6例配對(duì)直腸癌病理TNM分期為Ⅲ期、Ⅳ期或Dukes分期為“C”、“D”期，增加了鑒定在直腸癌中異常表達(dá)miRNA的靈敏性。直

6、腸癌組織miRNA的基因表達(dá)譜
　　 我們采用miRCURYTM Array LNA microRNA chip(v.14.0)基因芯片比較直腸癌組織和鄰近非腫瘤組織之間miRNA表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間miRNA表達(dá)譜存在著顯著不同，當(dāng)設(shè)定平均上升倍數(shù)大于2倍和P值小于0.05為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了直腸癌組織中有88個(gè)miRNAs呈顯著上調(diào)表達(dá)和40個(gè)miRNAs呈顯著下調(diào)表達(dá)。將我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)直腸癌(CRC)中異常表達(dá)的

7、miRNAs比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在88個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNAs中，47個(gè)已證實(shí)在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)。在40個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNAs中，15個(gè)miRNAs己報(bào)道在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)。我們?cè)谥蹦c癌組織中新發(fā)現(xiàn)了66個(gè)miRNAs異常表達(dá)。RT-qPCR分析異常表達(dá)的miRNAs
　　 選取上調(diào)或下調(diào)差異相對(duì)高的12個(gè)miRNAs，采用RT-qPCR在27例配對(duì)直腸癌與其對(duì)應(yīng)正常直腸組織中分析這些miRNAs表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯

8、示，所有6個(gè)在芯片篩選出的上調(diào)表達(dá)的miRNAs在27個(gè)直腸癌腫瘤組織中也異常高表達(dá)，與芯片結(jié)果相比較，表達(dá)水平相差從-11.88％到39.09％；同樣所有6個(gè)在芯片篩選出的下調(diào)表達(dá)的miRNAs在腫瘤組織中也呈低表達(dá)，與芯片結(jié)果相比較，表達(dá)水平相差從1.35％到29.35％。對(duì)芯片與RT-qPCR分析結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)比上調(diào)表達(dá)miRNAs其R值為0.707(P<0.05)，下調(diào)表達(dá)miRNA其R值為0.923(

9、P<0.01)，12個(gè)miRNAs相關(guān)性的R值為0.958(P<0.01)。miRNAs可特異性地調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，這些miRNAs在腫瘤組織中的異常表達(dá)可能與直腸癌的癌變與惡性演進(jìn)相關(guān)。結(jié)腸癌和直腸癌組織中miRNA表達(dá)模式與表達(dá)水平存在差異結(jié)直腸癌應(yīng)該被看作是包含多種疾病的一個(gè)“復(fù)合”概念。為了分析miRNA表達(dá)模式與表達(dá)水平在結(jié)腸癌和直腸癌組織中是否存在差異，我們選擇了4個(gè)miRNAs，檢測(cè)25例配對(duì)結(jié)腸癌及正常組織與27例配對(duì)直

10、腸癌及正常組織miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與配對(duì)的正常組織比較中，miR-452在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平增加3.03倍，在直腸癌組織中也增加2.99倍，他們之間增加的表達(dá)水平非常相似。miR-126雖然在結(jié)腸癌和直腸癌組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)(p<0.01)，但它在結(jié)腸癌組織中增加6.34倍，而在直腸癌組織中只上升了2.01倍，兩個(gè)亞型癌組織中miRNAs的表達(dá)水平存在顯著性差異(p<0.01)。miR-143在結(jié)腸癌組織中下降了4.8

11、2倍(p<0.01)；雖然它在直腸癌組織中也下調(diào)，但與正常直腸組織比較無(wú)顯著性差異。miR-31表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織中增加4.06倍，但它在直腸癌組織中上升高達(dá)13.4倍，在兩個(gè)亞型癌組織中miRNAs的表達(dá)水平存在顯著性差異(p<0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，miRNAs在兩個(gè)亞型癌組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式與表達(dá)水平，這可能與兩者的不同病理進(jìn)程相關(guān)。miRNA的表達(dá)水平與直腸癌的惡性演進(jìn)相關(guān)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs的靶基

12、因與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，并提出了“metastamir”概念，miRNAs的異常表達(dá)可能與直腸癌的惡性演進(jìn)相關(guān)。我們選取了可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miR-31和miR-145，采用RT-qPCR分析其在27例不同病理階段的直腸癌組織中表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常直腸組織比較，miR-31在A期病理標(biāo)本中表達(dá)水平明顯上升，但其表達(dá)水平比C期與D期病理標(biāo)本明顯降低，p值分別是0.012和0.015。雖然B期和C期病理標(biāo)本之間miR-31表

13、達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(p值為0.115)，但D期與B期病理標(biāo)本間存在顯著性差異(p<0.01)。相反，miR-145表達(dá)水平的降低與直腸癌的惡性進(jìn)展相關(guān)。miR-145在D期病理標(biāo)本中表達(dá)最低，與A、B、C期病理標(biāo)本比較，p值分別為0.002、0.014和0.112。結(jié)果提示：miR-31表達(dá)水平的上調(diào)與miR-145下調(diào)程度與直腸癌的病理分期相關(guān)，它們可能參與了直腸癌惡性演進(jìn)的過程。
　　 結(jié)論：在直腸癌組織中，我們鑒定了一批新