補腎法、疏肝法提高IVF-ET患者卵母細胞質量與顆粒細胞BMPs及其Smads信號通路的關系.pdf

1、我國不孕癥發(fā)病率為7％-10％，其中卵巢因素占女性不孕的25％-35％。體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)是目前治療不孕癥的主要手段之一，為不孕癥患者帶來了生育新生命的希望。但卵巢功能下降，促排卵時卵巢反應性差，獲得的卵母細胞少且質量下降，助孕后妊娠率低下且流產(chǎn)率高?？梢姡涯讣毎馁|量對于受精、胚胎發(fā)育和妊娠的建立以及胎兒的發(fā)育具有深刻的影響。
　　 卵母

2、細胞質量研究在IVF-ET技術工作中具有重要意義。IVF-ET中超過80％的胚胎著床失敗，為了提高妊娠率，目前廣泛應用的是多胚胎移植技術，因此多胎妊娠率較自然妊娠明顯增多，而多胎妊娠增加出生的新生兒早產(chǎn)、死產(chǎn)、低出生體重、出生缺陷及妊娠期高血壓疾病等并發(fā)癥的風險。因此，提高卵母細胞質量和胚胎質量對提高IVF妊娠率和孕育健康子代具有重大意義。
　　 卵母細胞能通過自身分泌的因子即卵母細胞分泌因子(Oocytesecretedfac

3、tors，OSFs)調節(jié)自身的成熟，并影響周圍顆粒細胞、卵泡膜細胞和間質細胞的功能。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(Bonemorphogeneticprotein-15，BMP-15)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6(Bonemorphogeneticprotein-6，BMP-6)都是OSFs成員。它們是卵母細胞分泌的糖蛋白，屬于轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族。在卵泡發(fā)育過程及早期胚胎中持續(xù)表達。研

4、究發(fā)現(xiàn)它們具有調節(jié)顆粒細胞的增殖分裂、卵丘擴展及卵泡膜細胞分化，抑制顆粒細胞凋亡等功能，對維持卵巢內健康卵泡的發(fā)育有重要作用。
　　 在TGF-β超家族的Smads信號通路中，BMP-15和BMP-6是配體，需與受體結合才能發(fā)揮作用。BMP-15和BMP-6分別與Ⅰ型受體和Ⅱ型受體結合，形成磷酸化復合物，引起下游信號分子活化調節(jié)靶基因的轉錄。BMP-15的膜受體是ALK6和BMPRII，BMP-6膜受體是ALK2、ALK6和BM

5、PRII。它們結合膜受體后，共同激活受體后的Smads信號通路，即受體結合型Smad1/5/8磷酸化與Smad4結合轉移進入細胞核，調節(jié)靶基因的轉錄。那么，BMP-15和BMP-6是否能提高卵母細胞質量，其提高卵母細胞質量的作用是否與Smads信號通路有關值得研究。
　　 近年來，中藥提高卵母細胞和胚胎質量以及妊娠結局的研究有很大進展。許多研究報道中藥可以提高卵母細胞質量和提高卵巢儲備功能，并從顆粒細胞凋亡、卵泡液代謝組學、卵泡

6、液離子濃度及卵巢血流等探討了中藥提高卵母細胞質量的作用機制。但目前尚未見中藥提高卵母細胞質量與卵泡液及顆粒細胞卵母細胞分泌因子關系方面的研究。
　　 臨床上補腎法、疏肝法是治療月經(jīng)病、不孕癥的常用治法，并且療效肯定。課題組的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)補腎法、疏肝法都具有調節(jié)卵巢功能、改善妊娠結局的作用。那么，補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量與卵泡液生殖激素和顆粒細胞BMP-15、BMP-6及其Smads信號通路的關系值得探討。
　　

7、 因此，本課題擬從以下五個方面開展研究:(1)補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵母細胞質量和妊娠結局的影響;(2)補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響;(3)補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-15表達的影響;(4)補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-6表達的影響;(5)補腎法、疏肝法IVF-ET患者顆粒細胞BMP-15、BMP-6的膜受體及受體后信號通路的影響。通過上述五個方面的研究，探

8、討補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量與卵泡液生殖激素和顆粒細胞BMP-15、BMP-6及其Smads信號通路的關系，以期揭示補腎法、疏肝法改善生殖功能的作用機制，這對于闡釋中醫(yī)調經(jīng)種子的作用機制、豐富和完善中醫(yī)生殖理論具有重要的意義。
　　 第一部分:補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵母細胞質量和妊娠結局的影響
　　 目的:探討補腎法、疏肝法對接受IVF-ET助孕的不孕癥患者促性腺激素用量、HCG日血清性激素濃度、獲卵率、受

9、精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率的影響，并比較兩法的作用有何異同。
　　 方法:選取符合納入標準和排除標準的接受IVF-ET助孕的不孕癥患者40例為治療組，其中符合腎虛型診斷標準的20例為補腎藥物組，口服補腎調經(jīng)方。符合肝郁型診斷標準的20例為疏肝藥物組，口服逍遙散方。另選同期接受符合納入標準和排除標準接受IVF-ET助孕的患者40例作為對照組。比較各組的年齡、不孕年限、基礎性激素濃度、促性腺激素用量、HCG注射日血清E2、

10、LH、P濃度、獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質胚胎率和臨床妊娠率。
　　 結果:1.補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組患者一般資料比較:各組之間患者年齡、不孕年限、基礎性FSH組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);2.補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組促性腺激素用量和HCG注射日血清E2、LH、P濃度比較:與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組HCG注射日血清E2、LH、P濃度組間無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組和疏肝藥物組相比，HCG注射日

11、血清E2、LH、P濃度組間無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組促性腺激素用量比較，與對照組相比，補腎藥物組低于對照組有顯著性差異(P＜0.05)，疏肝藥物組低于對照組有顯著性差異(P＜0.05)，補腎藥物組與疏肝藥物組比較差異無顯著性(P＞0.05)。3.補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質胚胎率和臨床妊娠率的比較:與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組獲卵數(shù)和受精率組間無顯著性差異(P＞0.05);

12、補腎藥物組和疏肝藥物組相比，獲卵數(shù)和受精率組間無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組優(yōu)質胚胎率比較:與對照組相比，補腎藥物組高于對照組，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組高于對照組，有顯著性差異(P＜0.05);補腎藥物組高于疏肝藥物組，但是差異無顯著性。補腎藥物組、疏肝藥物組和對照組臨床妊娠率比較:與對照組比較，補腎藥物組和疏肝藥物組臨床妊娠率有增高的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)，補腎藥物組和疏肝藥

13、物組比較，補腎組略高于疏肝組，但無顯著性差異(P＞0.05)。4.妊娠組與未妊娠組患者一般資料比較:進一步將各組患者分為妊娠組與未妊娠組進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間年齡、不孕年限、基礎FSH水平、促性腺激素用量和HCG注射日血清E2、LH、P濃度獲卵數(shù)、受精率的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而優(yōu)質胚胎率妊娠組高于未妊娠組，其差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 小結:本部分結果發(fā)現(xiàn)，補腎法、疏肝法都有增加優(yōu)質胚胎率、降

14、低促性腺激素用量的作用。而優(yōu)質胚胎率是最常用的卵母細胞及胚胎質量的評價標準，據(jù)此認為補腎法和疏肝法都有提高卵母細胞質量的作用。
　　 第二部分:補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響
　　 目的:通過觀察補腎藥物和疏肝藥物對IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響，研究補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量與卵泡液生殖激素的關系。
　　 方法:采用化學發(fā)光微粒子免疫法測定卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度。

15、
　　 結果:1.對照組、補腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度組間比較:與對照組相比，補腎藥物組、疏肝藥物組卵泡液FSH濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。補腎藥物組與疏肝藥物組之間卵泡液FSH濃度比較無顯著性差異(P＞0.05)。與對照組相比，補腎藥物組卵泡液LH濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。疏肝藥物組與對照組之間和補腎藥物組與疏肝藥物組之間卵泡液LH濃度比較無顯著性差

16、異(P＞0.05)。與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液E2濃度均增高，但差異無顯著性(P＞0.05);補腎藥物組與疏肝藥物組卵泡液E2濃度比較無顯著性差異(P＞0.05)。與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液T濃度增高，但差異無顯著性(P＞0.05);補腎藥物組與疏肝藥物組卵泡液T濃度比較無無顯著性差異(P＞0.05)。與對照組相比，補腎藥物組卵泡液P濃度比較無無顯著性差異(P＞0.05);疏肝藥物組卵泡液P濃度明顯增高，

17、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);疏肝藥物組卵泡液P濃度明顯高于補腎藥物組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2.妊娠組與未妊娠組卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度比較:進一步將各組患者分為妊娠組與未妊娠組進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間卵泡液FSH、E2、T和P濃度比較均無顯著性差別(P＞0.05);妊娠組卵泡液LH濃度明顯高于未妊娠組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 小結:補腎法和疏肝法卵泡液中FSH的濃度的較低，與降低

18、的促性腺激素藥物用量及增強卵巢反應性有關。補腎法可提高卵泡液中LH的濃度，疏肝法可提高卵泡液中P的濃度，這可能是補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量的作用途徑之一。并且補腎法和疏肝法的作用機制不同。
　　 第三部分:補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-15表達的影響
　　 目的:通過觀察補腎藥物和疏肝藥物對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-15mRNA及其蛋白表達的影響，研究補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量與調

19、控卵巢顆粒細胞BMP-15表達的關系。
　　 方法:采用Real-TimePCR(Real-TimeReverseTranscriptionPCR)、細胞免疫熒光法和Westernblot方法檢測顆粒細胞上BMP-15mRNA及其蛋白的表達。
　　 結果:1.Real-TimePCR法檢測各組卵巢顆粒細胞上BMP-15mRNA的表達:各組顆粒細胞上都有BMP-15mRNA的表達。與對照組相比，補腎藥物組、疏肝藥物BMP-

20、15mRNA的表達均增高，有顯著性差異(P＜0.01)。補腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.細胞免疫化學發(fā)光法觀察各組卵巢顆粒細胞上BMP-15蛋白的表達:各組顆粒細胞上都有BMP-15蛋白的表達。在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點狀熒光分布。與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組BMP-15蛋白的表達均增高，有顯著性差異(P＜0.01);補腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(

21、P＞0.05)。3.Westernblot法觀察各組卵巢顆粒細胞上BMP-15蛋白表達:各組顆粒細胞上都有BMP-15蛋白的表達。與對照組相比，補腎藥物組和疏肝藥物組均增高，有顯著性差異(P＜0.05)。補腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.進一步將對照組患者分為妊娠組與未妊娠組進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間妊娠組BMP-15mRNA的表達高于未妊娠組，有顯著性差異(P＜0.05)。細胞免疫熒光法、We

22、sternblot法檢測BMP-15蛋白的表達妊娠組均高于未妊娠組，均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 小結:補腎法和疏肝法均可上調IVF-ET患者顆粒細胞上BMP-15的表達，并且妊娠組BMP-15表達高于未妊娠組，因此補腎法和疏肝法可以通過促進顆粒細胞上BMP-15的表達提高卵母細胞質量。推測在卵泡發(fā)育的過程中補腎法和疏肝法上調BMP-15表達而促進顆粒細胞的有絲分裂和增殖，從而促進卵母細胞發(fā)育。
　

23、　 第四部分:補腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-6表達的影響
　　 目的:通過觀察補腎藥物和疏肝藥物對IVF-ET患者卵泡液中BMP-6蛋白表達及卵巢顆粒細胞BMP-6mRNA和蛋白表達的影響，探討補腎法、疏肝法提高卵母細胞質量與卵巢顆粒細胞BMP-6表達的關系。
　　 方法:采用Westemblot方法檢測卵泡液BMP-6蛋白的表達;Real-TimePCR、細胞免疫熒光法和Westernblot方

24、法檢測顆粒細胞上BMP-6mRNA和蛋白的表達。
　　 結果:1.Westernblot法檢測卵泡液中BMP-6蛋白表達:各組卵泡液都檢測出BMP-6蛋白。與對照組相比，補腎藥物組BMP-6蛋白表達明顯增高有顯著性差異，(P＜0.05)。疏肝藥物組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。補腎藥物組和疏肝藥物組相比，補腎藥物組卵泡液中BMP-6蛋白表達明顯高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.01)。2.Real-TimePCR法檢測顆

25、粒細胞上BMP-6mRNA表達:各組顆粒細胞上都有BMP-6mRNA的表達。與對照組相比，補腎藥物組顆粒細胞上BMP-6mRNA表達明顯增高，有顯著性差異(P＜0.01)。疏肝藥物組差異無顯著性(P＞0.05)。補腎藥物組顆粒細胞上BMP-6mRNA表達明顯高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.01)。3.細胞免疫化學發(fā)光法觀察顆粒細胞上BMP-6蛋白表達:各組顆粒細胞上都有BMP-6蛋白的表達。在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的

26、綠色點狀熒光分布。與對照組相比，補腎藥物組顆粒細胞上BMP-6蛋白表達明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組和疏肝藥物組顆粒細胞上BMP-6蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)。4.Westernblot法觀察顆粒細胞上BMP-6蛋白表達:各組顆粒細胞上都有BMP-6蛋白的表達。與對照組相比，補腎藥物組BMP-6蛋白表達明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組無顯著性差異，(

27、P＞0.05)。補腎藥物組和疏肝藥物組BMP-6蛋白表達相比，無顯著性差異(P＞0.05)。5.進一步將對照組患者分為妊娠組與未妊娠組進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間妊娠組卵泡液BMP-6蛋白表達明顯高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.01)。妊娠組顆粒細胞BMP-6mRNA的表達明顯高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.05)。細胞免疫熒光法和Westernblot法觀察BMP-6蛋白表達:妊娠組高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.05）。

28、>　　 小結:補腎法可明顯增加卵泡液及顆粒細胞中BMP-6mRNA及其蛋白的表達，提示補腎法提高卵母細胞質量的作用可能與上調卵泡液及顆粒細胞中BMP-6的表達有關，而疏肝法對卵泡液及顆粒細胞BMP-6的表達無明顯影響。補腎法和疏肝法提高卵母細胞質量的作用機制有同有異。同時發(fā)現(xiàn)妊娠組卵泡液及顆粒細胞BMP-6表達均明顯高于未妊娠組。首次證明了BMP-6在卵母細胞發(fā)育、促進妊娠的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第五部分補腎法、疏肝法對

29、IVF-ET患者顆粒細胞BMP-15、BMP-6的膜受體及受體后信號通路的影響
　　 目的:通過觀察補腎藥物和疏肝藥物對IVF-ET患者卵巢顆粒細胞BMP-15、BMP-6膜受體及受體后信號通路的影響，探討補腎法、疏肝法提高卵母細胞質量與卵巢顆粒細胞Smads信號通路的關系。
　　 方法:采用Real-TimePCR、細胞免疫熒光法檢測顆粒細胞上ALK2、ALK6、BMPRII、Smad1、Smad5、Smad8和Sma

30、d4mRNA及其蛋白的表達;Westernblot方法檢測顆粒細胞上Smad1的表達。
　　 結果:1.Real-TimePCR法檢測顆粒細胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRIImRNA的表達:各組顆粒細胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRIImRNA均有表達，三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。2.細胞免疫熒光法觀察顆粒細胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRII的表達:各組顆粒細胞上都有ALK2、ALK6、BM

31、PRII蛋白的表達，在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點狀熒光分布。三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。3.Real-TimePCR法檢測顆粒細胞上Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA的表達:各組顆粒細胞上均有Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA的表達。與對照組相比，補腎藥物組Smad1mRNA明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)。疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組

32、Smad1mRNA高于疏肝藥物組，差異有顯著性（P＜0.05）。Smad5、Smad8和Smad4mRNA三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。4.細胞免疫熒光法觀察顆粒細胞上Smad1、Smad5、Smad8和Smad4的表達:各組顆粒細胞上都有Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白的表達，在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點狀熒光分布。與對照組相比，補腎藥物組Smad1蛋白表達明顯增高于，差異有顯著性(P

33、＜0.05)。疏肝藥物組差異無顯著性(P＞0.05)。補腎藥物組Smad1蛋白表達高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.05)。Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。5.Westernblot檢測顆粒細胞上Smad1蛋白表達:與對照組相比，補腎藥物組Smad1蛋白表達明顯增高于對照組，差異有顯著性(P＜0.05)。疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補腎藥物組Smad1蛋白表達高于疏肝

34、藥物組，差異有顯著性(P＜0.05)。6.進一步將對照組患者分為妊娠組與未妊娠組進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間顆粒細胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRII和Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA和蛋白的表達，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 小結:補腎法和疏肝法對顆粒細胞BMPs的膜受體ALK2、ALK6、BMPRII的表達均無影響;對顆粒細胞Smad5、Smad8和Smad4的表達均無影響。但是補腎法可以上調S

35、mad1表達，Smad1表達增加可以增強上游細胞因子的作用，這可能是補腎法提高卵子質量作用的途徑之一，而疏肝法無此作用。
　　 結論:補腎法、疏肝法均有增加優(yōu)質胚胎數(shù)及降低促性腺激素用量的作用。提示補腎法和疏肝法均可提高卵母細胞質量作用。BMP-6在妊娠組卵泡液及顆粒細胞的表達均明顯高于未妊娠組。首次證實了BMP-6在卵子發(fā)育、促進妊娠的過程中發(fā)揮重要作用。補腎法和疏肝法均可降低卵泡液中FSH的濃度，進而減少促性腺激素藥物的用量