補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對IVF-ET妊娠結(jié)局及顆粒細(xì)胞凋亡和OSFs的影響.pdf

1、不孕不育癥是影響人類生殖健康的常見病和多發(fā)病，在我國發(fā)病率約為7％-10％體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)技術(shù)目前已成為臨床治療不孕不育癥最科學(xué)、最有效的主要技術(shù)手段之一，近年來，IVF-ET取得了很大的進(jìn)展，但臨床妊娠率仍然較低，且多胎妊娠發(fā)生率和流產(chǎn)率較高。在IVF-ET過程中，卵母細(xì)胞質(zhì)量與受精、胚胎發(fā)育及妊娠關(guān)系密切，目前優(yōu)化控制性超促排卵方案仍然

2、是改善卵子質(zhì)量的最主要的途徑。近年來，中藥用于提高卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量以及妊娠結(jié)局的研究有很大進(jìn)展。本課題組前期研究了補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對無排卵模型大鼠生殖功能的影響，證實(shí)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮促進(jìn)卵泡發(fā)育，誘發(fā)排卵，并可促進(jìn)子宮發(fā)育，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜微環(huán)境以利于孕卵著床的作用。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方在聯(lián)合IVF-ET治療不孕癥的臨床應(yīng)用。
　　 由于顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在廣泛的包括縫隙連接在內(nèi)的復(fù)雜

3、連接機(jī)制，在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育、排卵、卵子受精及胚胎種植等方面發(fā)揮重要的作用；卵母細(xì)胞分泌的卵母細(xì)胞分泌因子(oocyte secreted factors，OSFs)通過旁分泌作用促進(jìn)顆粒細(xì)胞增生、分化并調(diào)節(jié)其功能，與顆粒細(xì)胞共同調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育過程。文獻(xiàn)報(bào)道，卵丘細(xì)胞( cumulus cell，CC)的凋亡狀態(tài)和OSFs直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。所以本研究以顆粒細(xì)胞凋亡和OSFs為切入點(diǎn)研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方調(diào)經(jīng)種子的作用機(jī)制。以期為不

4、孕癥的中醫(yī)藥治療和IVF-ET的中醫(yī)輔助用藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)
　　 第一部分：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的影響
　　 目的：觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對體外受精-胚胎移植超排卵周期妊娠結(jié)局的影響。
　　 方法：收集因輸卵管因素行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）技術(shù)助孕，并符合中醫(yī)腎虛不孕癥辨證標(biāo)準(zhǔn)的女性患者60例，隨機(jī)分為中藥補(bǔ)

5、腎調(diào)經(jīng)方+西藥控制性超排卵組（實(shí)驗(yàn)組）30例和單純西藥控制性超排卵組（對照組）30例。觀察并記錄兩組患者HCG日血清E2、P、LH水平、促性腺激素(gonadotropin，Gn)使用天數(shù)和劑量、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率及并發(fā)癥情況。
　　 結(jié)果：(1)HCG日兩組患者血E2、LH、P值比較：兩組患者在HCG日血LH、P水平無顯著差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組的E2水平明顯高于對照組（P＜0.05）

6、。(2)Gn總量、Gn天數(shù)及獲卵數(shù)的比較：兩組患者Gn總量、Gn天數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組獲卵數(shù)高于對照組，有顯著性差異(P＜0.01)。(3)實(shí)驗(yàn)室評定成熟卵率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率比較：實(shí)驗(yàn)組成熟卵率86.70％、2PN受精率76.84％、卵裂率96.79％、優(yōu)質(zhì)胚胎率64.90％。對照組成熟卵率83.80％、2PN受精率66.07％、卵裂率95.72％、優(yōu)質(zhì)胚胎率54.06％。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組在成熟卵率、卵裂率方面差異

7、無顯著性(均P＞0.05)。而在受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率方面實(shí)驗(yàn)組高于對照組(均P＜0.05)。(4)臨床妊娠率比較：實(shí)驗(yàn)組臨床妊娠22例，妊娠率73.33％;對照組臨床妊娠14例，妊娠率46.67％，兩組臨床妊娠率差異有顯著性(P＜0.05)。(5)相關(guān)并發(fā)癥比較：實(shí)驗(yàn)組發(fā)生OHSS1例，胎停育1例；對照組無OHSS病例，自然流產(chǎn)1例。無其它并發(fā)癥發(fā)生。兩組OHSS及流產(chǎn)發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：在體外受精-胚胎移植控制性促

8、排卵同時(shí)，加用中藥補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可以增加獲卵數(shù)，并提高受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率。
　　 第二部分：人顆粒細(xì)胞凋亡及OSFs與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系
　　 目的：通過檢測人單個(gè)卵母細(xì)胞對應(yīng)顆粒細(xì)胞的凋亡率和對應(yīng)卵泡液中卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9和BMP-15的含量，進(jìn)一步闡明顆粒細(xì)胞凋亡及卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9和BMP-15與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系。
　　 方法：收集因輸卵管性不孕接受IVF-ET治療的患者。

9、經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵，每側(cè)卵巢穿刺時(shí)首先選擇一個(gè)直徑≥18mm卵泡抽吸，將該卵泡的卵泡液單獨(dú)留于一管內(nèi)，置于顯微鏡下找卵，若找到卵-冠-丘復(fù)合物(COC)，經(jīng)過卵母細(xì)胞成熟度分型，并將該卵母細(xì)胞行微滴受精及培養(yǎng)，于受精后16-18h評估受精情況，受精24h后評估受精卵的卵裂情況，于受精后第3天(4-8細(xì)胞期)，給予胚胎評分。分組方法：一組為形成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞，稱為優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組；另一組為未成熟、未受精及未形成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞，稱為

10、非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組。將對應(yīng)的卵泡液離心，用人淋巴細(xì)胞分離液分離出顆粒細(xì)胞，采用脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測顆粒細(xì)胞的凋亡率；采用western-blot方法檢測卵泡液中GDF-9和BMP-15的含量。分別分析顆粒細(xì)胞凋亡及GDF-9和BMP-15與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系。
　　 結(jié)果：(1)共觀察了69枚卵母細(xì)胞，其中形成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞36枚，未形成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞33枚（其中未成熟卵5枚，未受精及

11、異常受精卵6枚）。TUNEL法測定GC的凋亡率，形成優(yōu)質(zhì)胚胎的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組GC凋亡率為12.746±3.73，未形成優(yōu)質(zhì)胚胎的非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組GC凋亡率為19.88±6.36，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。(2)優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組的GDF-9蛋白含量為2.4983±0.1328，非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組為1.3052±0.406，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P=0.0084＜0.01)，結(jié)果顯示：發(fā)育潛能較好的卵母細(xì)胞相應(yīng)卵泡液中GDF-9的含量較高

12、。(3)優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組的BMP-15蛋白含量為3.3785±0.4823，非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組為1.336±0.2139，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P=0.0026＜0.01)，結(jié)果顯示：發(fā)育潛能較好的卵母細(xì)胞相應(yīng)卵泡液中BMP-15的含量較高。
　　 結(jié)論：優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組顆粒細(xì)胞的凋亡率低，提示顆粒細(xì)胞凋亡可能影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量及胚胎的體外發(fā)育潛能。在優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞組卵泡液中GDF-9和BMP-15水平及顆粒細(xì)胞中GDF-9和BMP-15m

13、RNA的表達(dá)均較高。
　　 提示人顆粒細(xì)胞的凋亡狀態(tài)及GDF-9、BMP-15水平可以反應(yīng)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，顆粒細(xì)胞凋亡率及GDF-9、BMP-15水平可以做為評價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)。
　　 第三部分：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對體外受精-胚胎移植超排卵周期顆粒細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對顆粒細(xì)胞凋亡的影響，探討其提高IVF-ET超排卵周期所獲卵和胚胎質(zhì)量的作用機(jī)制。
　　 方法：收集因輸卵管因素行IV

14、F-ET技術(shù)助孕，并符合中醫(yī)腎虛不孕癥辨證標(biāo)準(zhǔn)的女性患者60例，隨機(jī)分為中藥補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方+西藥控制性超排卵組（實(shí)驗(yàn)組）30例和單純西藥控制性超排卵組（對照組）30例。留取兩側(cè)卵巢所有直徑≥18mm的主導(dǎo)卵泡的卵泡液，用人淋巴細(xì)胞分離液分離出顆粒細(xì)胞，采用脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測顆粒細(xì)胞的凋亡率；采用免疫組化法測定顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀法測定顆粒細(xì)胞凋亡率。分析補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方

15、與顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 結(jié)果：(1)TUNEL法測定兩組顆粒細(xì)胞的凋亡率：實(shí)驗(yàn)組的凋亡率為13.61±4.53；對照組為19.41±5.95。兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)．加用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方后可以降低顆粒細(xì)胞的凋亡率。(2)Caspase3在兩組顆粒細(xì)胞中的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組Caspase3表達(dá)陽性率為48.08±11.24％，對照組Caspase3表達(dá)陽性率為68.58±10.31％，實(shí)驗(yàn)組顯著低于對照組(P＜0.01

16、)。(3)流式細(xì)胞儀方法測定兩組顆粒細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA含量：實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA含量為1.26±0.24％，對照組顆粒細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA含量為3.61±1.6％，實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA含量顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可降低顆粒細(xì)胞的凋亡率及凋亡細(xì)胞DNA的含量，下調(diào)顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase3的表達(dá)。提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方提高卵母細(xì)胞質(zhì)量可能與降低顆粒細(xì)胞的凋亡率有關(guān)，其機(jī)制可

17、能與抑制caspase3的表達(dá)有關(guān)。
　　 第四部分：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對體外受精-胚胎移植周期卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9和BMP-15的影響
　　 目的：研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對GDF-9和BMP-15的影響，探討其提高IVF-ET超排卵周期所獲卵和胚胎質(zhì)量的作用機(jī)制。
　　 方法：收集因輸卵管因素行IVF-ET技術(shù)助孕，并符合中醫(yī)腎虛不孕癥辨證標(biāo)準(zhǔn)的女性患者60例，隨機(jī)分為中藥補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方+西藥控制性超排卵組（實(shí)驗(yàn)組）30例和

18、單純西藥控制性超排卵組（對照組）30例。留取兩側(cè)卵巢所有直徑≥18mm的主導(dǎo)卵泡的卵泡液，用人淋巴細(xì)胞分離液分離出顆粒細(xì)胞。采用western-blot方法檢測卵泡液中GDF-9和BMP-15的含量，采用RT-PCR方法檢測顆粒細(xì)胞中GDF-9和BMP-15的表達(dá)。分析補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與GDF-9和BMP-15的關(guān)系。
　　 結(jié)果：(1)兩組卵泡液GDF-9結(jié)果比較治療組卵泡液GDF-9水平(2.7305±0.1260)顯著高于對照組

19、（2.0564±0.3055），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(2)兩組顆粒細(xì)胞GDF-9mRNA表達(dá)的電泳結(jié)果：治療組GDF-9mRNA表達(dá)(21807.0±1998.6)顯著高于對照組(10177.0±2571.4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)兩組卵泡液BMP-15蛋白質(zhì)測定結(jié)果：治療組卵泡液BMP-15水平（2.6454±0.4008），顯著高于對照組(1.6252±0.4371)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

20、）。(4)顆粒細(xì)胞BMP-15mRNA表達(dá)的電泳結(jié)果：治療組BMP-15mRNA表達(dá)(11894.0±865.6)顯著高于對照組(6441.0±794.6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可增加卵泡液中GDF-9和BMP-15的含量，并上調(diào)顆粒細(xì)胞中GDF-9和BMP-15的表達(dá)。
　　 綜上所述，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可能通過降低顆粒細(xì)胞凋亡率，增加GDF-9和BMP-15水平來改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高受