補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞BMP-15及其Smads信號通路影響的研究.pdf

1、目的:本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸均可提高IVF-ET控制性促排卵患者的臨床妊娠率，并增加卵泡液中BMP-15的蛋白含量和顆粒細(xì)胞中BMP-15mRNA的表達(dá)，提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸促進(jìn)卵泡發(fā)育、改善卵子質(zhì)量的作用可能與其調(diào)控卵母細(xì)胞分泌因子BMP-15的分泌有關(guān)。BMP-15與細(xì)胞膜上BMPRⅡ和ALK6結(jié)合激活Smad1/5/8進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，BMP-15及其Smads信號通路對卵泡發(fā)生發(fā)育、卵丘擴(kuò)散、卵母細(xì)胞的成熟

2、起著重要作用。本研究將補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸作為補(bǔ)腎法、疏肝法的代表方劑。在前期研究基礎(chǔ)上，通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討補(bǔ)腎法、疏肝法提高小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量與調(diào)控BMP-15及其Smads信號通路的關(guān)系，比較兩法的作用機(jī)制和環(huán)節(jié)有何異同。為中醫(yī)藥作為IVF-ET控制性促排卵的輔助用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選用6-7周齡健康雌性昆明小鼠900只，分6批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每批150只，隨機(jī)分為6組:疏肝低劑量組、疏肝高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、補(bǔ)腎高

3、劑量組、空白對照組和COH組，每組25只（6批每組合計(jì)150只）。實(shí)驗(yàn)用逍遙丸為河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，將200、100丸逍遙丸溶于125ml蒸餾水中制成混懸液，高劑量含生藥0.6g/ml，低劑量含生藥0.3g/ml;補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方所需藥材一次性購自石家莊市樂仁堂藥店，并由本校中藥系制成口服液，高劑量含生藥5.4g/ml，低劑量含生藥2.7g/ml，置4℃冰箱中備用（高、低劑量相當(dāng)于臨床用量的20、10倍）。疏肝低、高劑量組（逍遙丸配

4、合PMSG）、補(bǔ)腎低、高劑量組（補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方配合PMSG）和COH組(PMSG)，分別用逍遙丸、補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和蒸餾水灌胃，1ml/100g體重，連續(xù)10天。各治療組及COH組于第11日同時腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU/只?？瞻讓φ战M每日陰道涂片，觀察動情周期。
　　 第一批小鼠于注射HCG16h后，疏肝低、高劑量組、補(bǔ)腎低、高劑量組和COH組各取15只小鼠;空白對照組于陰道涂片見大量角化上皮細(xì)胞次日，

5、取15只小鼠，均脫頸椎處死，取出雙側(cè)輸卵管，置于滅菌培養(yǎng)皿中。在體視鏡下用1ml注射器針頭劃破輸卵管壺腹部，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，迅速檢查并記錄排卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)。然后用0.05％的透明質(zhì)酸酶消化掉卵丘顆粒細(xì)胞，再用PBS反復(fù)沖洗，以獲得MⅡ期卵母細(xì)胞。迅速將其置于冰上，用于實(shí)時熒光定量PCR。各組剩余10只小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞獲取方法同上，將其置于-80℃保存?zhèn)溆?用于Westernblot)。
　　 第二批小鼠

6、于注射HCG同時，將疏肝低、高劑量組、補(bǔ)腎低、高劑量組和COH組各取20只小鼠;空白對照組于陰道涂片見到大量角化上皮細(xì)胞時，取20只小鼠，與8-9周齡雄性昆明小鼠按1∶1比例合籠，觀察各組的妊娠率。各組剩余5只小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞獲取方法同上，將其放入4％的多聚甲醛中固定（用于免疫組化）。
　　 第三批至第六批小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞獲取方法同上，將一部分放入4％的多聚甲醛中固定（用于免疫組化），另一部分置于-80℃保存?zhèn)溆?用于W

7、esternblot)。
　　 采用Westernblot、免疫組化法檢測卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8蛋白的表達(dá);采用實(shí)時熒光定量PCR檢測上述指標(biāo)mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、疏肝低、高劑量組和補(bǔ)腎低、高劑量組小鼠排卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)及妊娠率的比較排卵數(shù)的比較:與空白對照組比較，COH組、疏肝低、高劑量組和補(bǔ)腎低、高劑量組的排卵數(shù)增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

8、均P＜0.05）。與COH組比較，疏肝低、高劑量組和補(bǔ)腎低、高劑量組的排卵數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。各治療組間獲卵數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率的比較:與空白對照組比較，COH組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率降低（均P＜0.05），疏肝高劑量組和補(bǔ)腎高劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率增高（均P＜0.05），疏肝低劑量組和補(bǔ)腎低劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率與其無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與COH組比較，疏肝低、高劑量組

9、和補(bǔ)腎低、高劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率均增高(均P＜0.05)。疏肝低劑量組和補(bǔ)腎低劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。疏肝高劑量組和補(bǔ)腎高劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。疏肝低劑量組、補(bǔ)腎低劑量組的優(yōu)質(zhì)卵泡率及妊娠率均低于疏肝高劑量組、補(bǔ)腎高劑量組（均P＜0.05）。
　　 2、疏肝低、高劑量組小鼠卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8m

10、RNA及其蛋白的表達(dá)與空白對照組比較，COH組卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與空白對照組、COH組比較，疏肝低、高劑量組卵母細(xì)胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表達(dá)升高（均P＜0.05），但其在疏肝低、高劑量組間的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）;疏肝低劑量組卵母細(xì)胞中BMPRⅡmRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），

11、疏肝高劑量組卵母細(xì)胞中BMPRⅡmRNA及其蛋白的表達(dá)增高（均P＜0.05）;疏肝低、高劑量組卵母細(xì)胞中ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)增強(qiáng)（均P＜0.05），且疏肝低劑量組卵母細(xì)胞中ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白表達(dá)的表達(dá)均低于高劑量組（均P＜0.05）。
　　 3、補(bǔ)腎低、高劑量組小鼠卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad

12、8mRNA及其蛋白的表達(dá)與空白對照組比較，COH組卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與空白對照組、COH組比較，補(bǔ)腎低、高劑量組卵母細(xì)胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)升高（均P＜0.05），且補(bǔ)腎低劑量組BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)均低

13、于高劑量組（均P＜0.05）。與空白對照組、COH組比較，補(bǔ)腎低、高劑量組卵母細(xì)胞中BMPRⅡmRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。
　　 4、疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵母細(xì)胞中BMP-15、BMPRⅡ、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白表達(dá)比較與疏肝低劑量組比較，補(bǔ)腎低、高劑量組卵母細(xì)胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)均升高（均P＜0.05）

14、，BMPRⅡmRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與疏肝高劑量組比較，補(bǔ)腎低劑量組卵母細(xì)胞中BMP-15、ALK6、Smad1mRNA及其蛋白的表達(dá)均升高(均P＜0.05)，BMPRⅡ、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)均降低(均P＜0.05);補(bǔ)腎高劑量組卵母細(xì)胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5mRNA及其蛋白的表達(dá)均升高（均P＜0.05），BMPRⅡmRNA及其蛋白的表達(dá)降低（均P＜0.05

15、），Smad8mRNA及其蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、逍遙丸和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方在不減少控制性超排卵小鼠排卵數(shù)的同時，可增加控制性超排卵小鼠的優(yōu)質(zhì)卵泡率和妊娠率。
　　 2、逍遙丸可通過上調(diào)小鼠卵母細(xì)胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。其機(jī)制可能為誘導(dǎo)BMP-15與其Ⅱ型受體BMPRⅡ形成復(fù)合物，然后募集Ⅰ型受體ALK6，并可能使其磷酸化而發(fā)生活化，活化的

16、Ⅰ型受體進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號因子Smad1/5/8，從而啟動信號傳導(dǎo)。高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。
　　 3、補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過上調(diào)小鼠卵母細(xì)胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。其機(jī)制可能為誘導(dǎo)BMP-15與其它Ⅱ型受體形成復(fù)合物，然后募集Ⅰ型受體ALK6，并可能使其磷酸化而發(fā)生活化，進(jìn)一步活化細(xì)胞內(nèi)信號因子Smad1/5/8，從而啟動信號傳導(dǎo)。高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。
　　 4、逍遙丸和補(bǔ)