補腎法、疏肝法對排卵障礙模型大鼠HPOA及人卵巢顆粒細胞分泌功能影響的比較研究.pdf

1、第一部分:補腎法、疏肝法對排卵障礙模型大鼠HPOA的影響
　　 目的:通過研究比較補腎法與疏肝法對排卵障礙模型大鼠HPOA影響的異同,探討補腎法、疏肝法治療排卵障礙性疾病的作用機制,以豐富中醫(yī)生殖理論,促進中醫(yī)婦科學(xué)的發(fā)展。
　　 方法:模型一:選用同批出生9日齡健康雌性SD大鼠204只,體重約15g。隨機取170只大鼠,于頸背部皮下一次性注射丙酸睪丸酮1.25mg/只(0.05ml/只)造模。第22日齡斷奶,自由進食,

2、同條件飼養(yǎng)。第70日齡陰道開口,造模組連續(xù)陰道上皮細胞涂片兩個性周期(一個性周期4.5天),陰道上皮細胞持續(xù)角化,提示雄激素致排卵障礙大鼠模型造模成功。余34只,于頸背部皮下一次性注射中性茶油0.05ml作為正常對照組。
　　 模型二:選用3月齡健康雌性Wistar大鼠204只,體重180～250g。隨機取170只大鼠改進鄭家潤,梁文波等方法。雷公藤多甙片35mg/kg/d(給藥劑量為臨床成人用量的20倍),灌胃法給藥,連續(xù)57

3、天。造模組連續(xù)陰道上皮細胞涂片兩個性周期,動情周期轉(zhuǎn)為不規(guī)則,主要為周期不完整及周期延長,提示雷公藤致排卵障礙大鼠模型造模成功。其余34只灌胃給蒸餾水作為正常對照組。
　　 將兩種排卵障礙成功模型大鼠分別隨機分為模型組和治療組,治療組包括:補腎調(diào)經(jīng)方高劑量組、補腎調(diào)經(jīng)方低劑量組、逍遙丸高劑量組、逍遙丸低劑量組,每組分別各34只；治療組分別灌服補腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸,模型組和正常組灌服蒸餾水,每日1次。灌胃給藥5周,并陰道細胞涂片兩個

4、性周期。最后一次給藥后禁食8小時,選擇相同動情周期(動情前期、動情后期)斷頭取血,制備血漿、血清,放免法檢測血漿卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)、催乳素(PRL)。同時立即無菌操作,在冰盤上取下部分腺垂體、卵巢、子宮,稱重后快速、輕柔地投入預(yù)冷的光鏡固定液內(nèi)固定。
　　 第二部分:補腎法、疏肝法對人卵巢顆粒細胞分泌功能的影響
　　 目的:通過卵巢顆粒細胞培養(yǎng),觀察兩法對卵巢

5、顆粒細胞分泌功能的影響,探討兩法對卵巢自分泌系統(tǒng)的影響,研究排卵障礙的發(fā)生與卵巢顆粒細胞分泌功能的關(guān)系,比較補腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸對人卵巢顆粒細胞分泌功能影響的異同,為補腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸治療排卵障礙性疾病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:取21只6周齡健康雌性大鼠按體重隨機分為7組,空白對照組每日灌服生理鹽水2ml/100g；補腎調(diào)經(jīng)方組低、中、高劑量組和逍遙丸高、中、低劑量組分別給予補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸。各組均于末次給藥后1小時

6、大鼠股動脈采血。室溫靜置2h,3000r/min離心10min,取上清,56℃水浴30min滅活補體,0.22μm無菌濾器過濾除菌、分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 選取年齡在20-30周歲,身體健康,因排卵障礙不孕就診于河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院門診部的女性志愿者4名。B超監(jiān)測未見成熟卵泡,并且排除卵巢,子宮器質(zhì)性疾病,雙側(cè)輸卵管造影結(jié)果顯示為通暢,近三月未服用激素。分別口服補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸。連續(xù)服藥3天,第4天清晨空腹服藥(服藥前

7、禁食12h),一次服用全天劑量,于末次給藥1小時后靜脈取血5ml,室溫靜置2h,3000r/min離心10min,取上清,56℃水浴30min滅活補體,0.22μm無菌濾器過濾除菌、分裝?？瞻籽宓闹苽?年齡在20-30周歲,身體健康,月經(jīng)規(guī)律,B超監(jiān)測有成熟卵泡,并且無卵巢,子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者1名,清晨空腹靜脈采血5ml,其余同人含藥血清制備。-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 將從河北省第二附屬醫(yī)院輔助生殖科取來的含有顆粒細胞

8、的卵泡液經(jīng)2000r/min離心,棄上清液,沉淀顆粒細胞,用DMEM培養(yǎng)基洗滌后,經(jīng)密度梯度為0.5Percoll懸液2500 r/min離心30min分離除去紅細胞。加入0.25％的胰蛋白酶,37℃消化5-10min左右,加入含有10％胎牛血清和1640培養(yǎng)液終止消化。PBS沖洗,離心。經(jīng)臺盼蘭染色細胞存活率85％-90％,用含有10％胎牛血清和1640培養(yǎng)液將顆粒細胞濃度調(diào)整為2×105的單細胞懸液,將單細胞懸液放入在24孔的的培養(yǎng)

9、板,每板1ml,在5％的CO2,37℃孵箱中培養(yǎng)。24h后細胞貼壁。分別加入補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸人含藥血清和大鼠含藥血清制成高劑量(18％)、中劑量(12％)、低劑量(6％)處理細胞48h。設(shè)加正常人和大鼠血清者為空白對照。
　　 結(jié)論:(1)兩種排卵障礙模型血清生殖激素均紊亂,垂體、卵巢、子宮形態(tài)均有異常；雄激素致無排卵模型卵巢、子宮重量指數(shù)降低。雄激素致無排卵模型對卵巢、子宮形態(tài)及重量指數(shù)降低要重于雷公藤致排卵障礙模型。(2)

10、補腎法、疏肝法通過改善垂體、卵巢、子宮形態(tài),調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌激素水平,增加卵巢、子宮重量指數(shù),發(fā)揮促進卵泡發(fā)育和成熟,治療排卵障礙性疾病的作用。補腎法在改善卵巢、子宮形態(tài),增加卵巢、子宮重量指數(shù),調(diào)節(jié)卵巢分泌血清生殖激素方面優(yōu)于疏肝法,疏肝法在改善垂體形態(tài),調(diào)節(jié)垂體分泌血清生殖激素方面優(yōu)于疏肝法。(3)補腎法、疏肝法可以改善人卵巢黃素化顆粒細胞分泌功能,調(diào)節(jié)卵巢的自分泌系統(tǒng),達到改善卵巢功能的作用。補腎法在提高人卵巢黃素化顆粒細胞E2、F