補(bǔ)腎法、疏肝法對排卵障礙模型大鼠卵巢血液供應(yīng)的比較研究.pdf

1、目的:無排卵或排卵障礙性疾病包括中醫(yī)的月經(jīng)不調(diào)、崩漏、閉經(jīng)、不孕癥等,臨床上運(yùn)用補(bǔ)腎法、疏肝法治療上述疾病療效顯著。前期及同期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):補(bǔ)腎法、疏肝法對排卵障礙模型大鼠性腺軸有很好的調(diào)節(jié)作用,但是補(bǔ)腎法、疏肝法促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)是否通過改善卵巢的血液供應(yīng)實(shí)現(xiàn)的,有待于我們進(jìn)一步研究。因此,我們建立兩種排卵障礙大鼠模型,并應(yīng)用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方作為補(bǔ)腎法的代表方劑,逍遙丸作為疏肝法的代表方劑,進(jìn)行干預(yù)。觀察比較這兩種治療方法對兩種排卵障礙模型大

2、鼠卵巢血管舒-縮因子及血管生成因子的影響,以期從卵巢血液供應(yīng)方面闡明補(bǔ)腎法和疏肝法促進(jìn)卵泡發(fā)育及排卵作用機(jī)制的異同,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),從而促進(jìn)中醫(yī)婦科治療學(xué)的發(fā)展。
　　 第一部分補(bǔ)腎法對排卵障礙模型大鼠卵巢血液供應(yīng)的影響
　　 方法:建立兩種排卵障礙大鼠模型:1.建立雄激素致無排卵大鼠模型,參照俞瑾等方法。即選用同批出生SD雌性大鼠204只,體重約15g。隨機(jī)取170只于出生第9天頸背部皮下注射丙酸睪丸酮0.05

3、ml/只,第70日齡時(shí)陰道脫落細(xì)胞涂片,當(dāng)陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化時(shí)提示模型制作成功。其余34只,于頸背部皮下一次性注射中性茶油0.05ml作為正常對照組。2.建立雷公藤致排卵障礙大鼠模型,改進(jìn)鄭家潤,梁文波等方法。三月齡雌性Wistar大鼠204只,體重180-250g,隨機(jī)取170只大鼠,雷公藤多甙片70mg/kg/d(給藥劑量為臨床成人用量的20倍,每周稱體重,調(diào)整給藥量),灌胃給藥,連續(xù)57天。動(dòng)情周期轉(zhuǎn)為不規(guī)則,主要為周期不完整及

4、周期延長,提示模型制作成功。其余34只灌胃給蒸餾水作為正常對照組。3.將兩種成模大鼠分別隨機(jī)分為治療高劑量組、治療低劑量組,模型組,另設(shè)相應(yīng)的正常對照組,每組平均34只；第一部分治療組灌服補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方,模型組和正常組灌服蒸餾水,每日一次。灌胃給藥5周,陰道細(xì)胞發(fā)生周期性變化時(shí)進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片兩個(gè)性周期(1個(gè)性周期4-5天),最后兩天每2小時(shí)涂片1次,詳細(xì)記錄各組大鼠的動(dòng)情周期。最后一次給藥后禁食水8小時(shí),依據(jù)各組大鼠陰道細(xì)胞涂片結(jié)果選擇動(dòng)

5、情前期和動(dòng)情后期,分批斷頭取血,制備血漿、血清,-20℃保存?zhèn)錂z；放免法檢測血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平,硝酸還原酶法檢測一氧化氮(NO)水平。同時(shí)立即無菌操作,在冰盤上取下左側(cè)卵巢組織,快速、輕輕地投入預(yù)冷的光鏡固定液小瓶內(nèi)固定,采用免疫組織化學(xué)染色,觀察卵巢組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表達(dá)強(qiáng)度。右側(cè)卵巢組織,吸去血跡,勻漿后采用放免法檢測卵巢組織中內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管緊

6、張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)、一氧化氮(NO)水平。
　　 第二部分疏肝法對排卵障礙模型大鼠卵巢血液供應(yīng)的影響
　　 方法:治療組灌服逍遙丸,其余同第一部分。
　　 第三部分補(bǔ)腎法、疏肝法對排卵障礙模型大鼠卵巢血液供應(yīng)的比較研究
　　 方法:同第一部分、第二部分
　　 結(jié)果:
　　 1兩法對排卵障礙模型大鼠血漿血管舒-縮因子水平影響的比較
　　 1.1雷公藤致排卵障礙模型
　　 1

7、.1.1對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO、cGMP含量升高；逍遙丸高、低劑量組ET-1、cGMP含量與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組相比,差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；逍遙丸高、低劑量組NO含量明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量組。
　　 1.1.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO含量升高,補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量和逍

8、遙丸高劑量均可使模型大鼠cGMP含量升高；逍遙丸低劑量組ET-1含量明顯低于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組；逍遙丸低劑量組NO含量明顯低于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量組；逍遙丸高、低劑量組cGMP含量與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組相比,差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2雄激素致無排卵模型
　　 1.2.1對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO含量升高,高劑量可使模型大鼠cGMP含量升高；逍

9、遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,cGMP含量升高,低劑量可使模型大鼠NO含量升高；逍遙丸高、低劑量組ET-1含量與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組相比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；逍遙丸低劑量組NO含量明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量組:逍遙丸高、低劑量組cGMP含量均明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組。
　　 1.2.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,但NO、cGMP含量較模型組均沒有

10、明顯變化；逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1含量降低,cGMP含量升高,低劑量可使模型大鼠NO含量升高；逍遙丸高、低劑量組ET-1含量與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組相比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；逍遙丸低劑量組NO含量明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組；逍遙丸高、低劑量組cGMP含量均明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組。
　　 2兩法對排卵障礙大鼠卵巢組織血管舒一縮因子水平影響的比較
　　 2.1雷公藤致排卵障礙模型
　　 2.1.1

11、對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,低劑量可使模型大鼠NO含量升高；逍遙丸高劑量可使模型大鼠ET-1、Ang—Ⅱ含量均降低,NO含量較模型組無明顯變化,低劑量組ET-1、Ang—Ⅱ、NO含量較模型組均無明顯變化；逍遙丸高、低劑量組與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組間卵巢組織ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.1.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　

12、　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量均可使模型大鼠NO含量升高,ET-1含量較模型組均無明顯變化,低劑量可使模型大鼠Ang-Ⅱ含量降低；逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量降低,NO含量升高；逍遙丸高、低劑量組與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組卵巢組織ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.2雄激素致無排卵模型
　　 2.2.1對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組Ang-Ⅱ

13、、NO含量較模型組均無明顯變化,高劑量可使模型大鼠ET-1含量降低；逍遙丸低劑量可使模型大鼠ET-1含量降低,高劑量可使模型大鼠Ang-Ⅱ含量降低,高、低劑量組NO含量均較模型組無明顯變化；逍遙丸高、低劑量組NO、Ang-Ⅱ含量與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組相比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；逍遙丸低劑量組ET-1含量明顯低于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組。
　　 2.2.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組Ang-Ⅱ、NO含量較

14、模型組均無明顯變化,低劑量可使模型大鼠ET-1含量降低；逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量降低,高、低劑量組NO含量較模型組無明顯變化；逍遙丸高、低劑量組Ang-Ⅱ含量均明顯低于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量組；逍遙丸高劑量組ET-1含量明顯低于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組；逍遙丸高、低劑量組與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)高、方低劑量組NO含量比較差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3兩法對排卵障礙模型大鼠卵巢組織血管生成因子表達(dá)影響的比較
　　

15、3.1雷公藤致排卵障礙模型
　　 3.1.1對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表達(dá)升高；逍遙丸高、低劑量組VEGF的表達(dá)均明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組；MVD的表達(dá)明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組。
　　 3.1.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表達(dá)升高；逍遙丸高、低劑量組VEGF的表達(dá)均明

16、顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組；逍遙丸高劑量組MVD的表達(dá)明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組。
　　 3.2雄激素致無排卵模型
　　 3.2.1對模型大鼠動(dòng)情前期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表達(dá)升高；逍遙丸高、低劑量組VEGF、MVD的表達(dá)均明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組。
　　 3.2.2對模型大鼠動(dòng)情后期的影響
　　 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與逍遙丸高、低劑量均可使模型大鼠V

17、EGF、MVD的表達(dá)升高；逍遙丸高、低劑量組與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量組VEGF的表達(dá),差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逍遙丸高、低劑量組MVD的表達(dá)明顯高于補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方低劑量組。
　　 結(jié)論:
　　 1兩種排卵障礙模型大鼠血管舒縮因子平衡失調(diào),卵巢局部供血障礙,影響了卵巢的功能,導(dǎo)致了排卵障礙的發(fā)生。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸均可使血管舒張因子NO、cGMP活性增強(qiáng),血管收縮因子ET-1、Ang-Ⅱ活性降低,使血管舒縮恢復(fù)正常,從而改善卵巢局部