顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)FSHR對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響研究.pdf

1、自Mattioli等于1988年首次對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)研究以來(lái)，在許多研究人員的努力下，雖然豬卵母細(xì)胞IVM體系得到了較大的改進(jìn)和優(yōu)化，但是IVM效果依然較差。影響卵母細(xì)胞IVM效果的因素有許多，如:IVM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的成分;IVM培養(yǎng)液中的添加成分:激素及其濃度、細(xì)胞因子、卵泡液、抗氧化物質(zhì)及維生素等;采取卵子的卵泡直徑大小;卵母細(xì)胞周圍包裹卵丘細(xì)胞的有無(wú)及數(shù)量多少;成熟培養(yǎng)時(shí)的溫度、氣相條件以及成熟培養(yǎng)時(shí)間等等。IVM過(guò)程

2、中卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟往往不同步，這也是導(dǎo)致IVM效果較差的關(guān)鍵因素之一。為了有效推動(dòng)豬卵母細(xì)胞核質(zhì)同步成熟，提高豬卵母細(xì)胞IVM效率，本研究在IVM中首次對(duì)顆粒細(xì)胞(GCs) FSH受體的過(guò)表達(dá)展開(kāi)設(shè)計(jì)，采用帶有新型熒光蛋白基因的慢病毒載體介導(dǎo)FSH受體基因轉(zhuǎn)染GCs，實(shí)現(xiàn)FSH受體在GCs膜上長(zhǎng)期、穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)。將卵母細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的GCs共培養(yǎng)進(jìn)行IVM，通過(guò)分析核質(zhì)成熟的進(jìn)程，闡明GCs膜上FSH受體過(guò)表達(dá)對(duì)豬卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的調(diào)節(jié)

3、機(jī)制，并以此來(lái)提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率。本試驗(yàn)具體從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:
　　1.豬FSHR基因的克隆及慢病毒表達(dá)載體CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus的構(gòu)建
　　Trizol試劑法提取豬卵巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA并擴(kuò)增豬FSHR基因。將FSHR基因首先連接到pMD19-T載體，然后運(yùn)用不完全酶切法將FSHR基因酶切下來(lái)并連接到慢病毒載體CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus上，構(gòu)建慢病毒重

4、組表達(dá)載體CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus。
　　2.豬卵泡顆粒細(xì)胞的體外分離純化培養(yǎng)
　　抽取豬卵巢上直徑為2-6mm的卵泡內(nèi)的卵泡液到一無(wú)菌的離心管，經(jīng)過(guò)離心、0.2％透明質(zhì)酸酶消化、PBS洗滌、0.25％胰酶消化等步驟后鋪至細(xì)胞培養(yǎng)皿。待鋪皿后第4天，顆粒細(xì)胞能完全鋪滿培養(yǎng)皿。經(jīng)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)一次后，將其在液氮內(nèi)凍存?zhèn)溆谩Ｔ趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們成功分離純化培養(yǎng)了豬原代卵泡顆粒細(xì)胞。所分離培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)較旺盛

5、，符合下步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　3.慢病毒的包裝
　　重組慢病毒表達(dá)載體穿梭質(zhì)粒:CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus，包裝質(zhì)粒pCAG-HIVgp和包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev，三質(zhì)粒用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并在293T細(xì)胞內(nèi)包裝出具有感染力的慢病毒顆?！闳∞D(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)濾后，感染293T細(xì)胞，以此來(lái)檢測(cè)包裝出來(lái)的慢病毒感染效果。
　　4.電穿孔法將重構(gòu)載體CSⅡ-EF-FSHR-I

6、RES2-Venus轉(zhuǎn)染豬卵泡顆粒細(xì)胞，并將其與豬卵母細(xì)胞在體外共培養(yǎng)
　　用電擊法將重構(gòu)慢病毒表達(dá)載體CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus轉(zhuǎn)染豬卵泡顆粒細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)卵子成熟后的第一極體排出率和受精后的卵裂率與對(duì)照組比較，闡明GCs膜上FSH受體過(guò)表達(dá)對(duì)豬卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　5.結(jié)果:FSH和LH在低濃度（0.01U/ml）時(shí)，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CSⅡ-EF-FSHR-I

7、RES2-Venus的顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)組）成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率和卵裂率顯著高于對(duì)照組（轉(zhuǎn)染CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus的顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)組和無(wú)顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)組）。但在高濃度激素（0.1U/ml）時(shí)，實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞第一板體排出率及卵裂率低于對(duì)照組。另外，有顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)組卵母細(xì)胞成熟率要高于無(wú)顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)組。
　　本實(shí)驗(yàn)為豬卵母細(xì)胞IVM探索了一種新的培養(yǎng)體系，旨在提高豬卵母細(xì)胞IVM過(guò)程中，其成熟發(fā)育