豬卵母細胞體外成熟及核移植研究.pdf

1、基于當前豬卵母細胞體外成熟和胚胎體外生產(chǎn)所存在的效率低下這一突出問題,本研究就豐富和優(yōu)化豬卵母細胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)培養(yǎng)及核移植胚胎的最佳培養(yǎng)條件,以其穩(wěn)定的獲取早期囊胚,及搭建豬體細胞核移植技術(shù)基礎(chǔ)平臺,為最終生產(chǎn)克隆豬提供依據(jù),開展了如下研究： 首先,我們比較了不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加Ghrelin和胰島素對豬卵母細胞IVM與成熟后孤雌發(fā)育的影響,嘗試將Ghrelin添加

2、到豬卵母細胞體外成熟液中,據(jù)我們查閱文獻所知,這在國內(nèi)外尚屬首次。我們還比較了50nM曲古抑菌素(TSA)處理0h、12h、24h、36h、48h對豬體細胞克隆胚胎發(fā)育的影響。最后,我們比較了胚胎培養(yǎng)基中添加胰島素對豬孤雌激活胚胎發(fā)育的影響。 具體研究結(jié)果如下： (1)以TCM199、DMEM和NCSU23為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加相同成分配制成豬卵母細胞IVM培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)以NCSU-23為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時,卵母細胞核成熟率最高,且

3、明顯優(yōu)于DMEM組(69.54±2.74％vs. 52.82±5.72％,P<0.05),成熟后激活胚胎發(fā)育NCSU-23組明顯優(yōu)于TCM-19和DMEM組(卵裂率74.25±8.39％vs. 60.25±1.42％vs。43.75±1.55％P<0.01)。 (2)以不同濃度Ghrelin(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)添加到相同豬卵母細胞IVM培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)添加Ghrelin各組

4、卵母細胞成熟率略低于對照組,但各組間差異不顯著(53.42±6.04％ vs. 51.37±5.37％ vs. 47.94±3.23％ vs. 47.71±3.18％ vs. 49.15±3.47％P>0.05);成熟后激活胚胎發(fā)育率Ghrelin添加組高于對照組,50ng/ml組卵裂率最高,但各組差異不顯著；100ng/ml組囊胚率最高,但各組間差異也不顯著。 (3)以不同濃度胰島素(0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/m

5、l、5μg/ml、10μg/ml)添加到相同豬卵母細胞IVM培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)添加胰島素各組卵母細胞成熟率高于對照組,5μ/mlg組成熟率最高,對照組最低,且5μg/ml與各組差異極顯著(81.84±2.54％ vs.61.96±1.82％ vs. 67.32±2.06％ vs. 70.53±2.31％ vs. 70.07±1.84％,P<0.01);2.5μg/ml組與對照組差異顯著(70.53±2.31％ vs. 61.96±1.82％

6、P<0.05);在后期胚胎發(fā)育中,5μg/ml卵裂率最高,且與對照組差異顯著(60.76±2.19％ vs. 48.84±2.44％ P<0.05),其他各組差異不顯著；同樣5μg/ml囊胚率最高,且與對照組差異極顯著(49.23±6.38％ vs. 30.11±1.37％ vs. 40.43±3.02％ vs. 39.52±5.02％ vs. 40.98±1.93％,P<0.01),其他各組差異不顯著。 (4)在胚胎培養(yǎng)液PZ

7、M3中添加50nM TSA,處理不同時間(0h、12h、24h、36h、48h),發(fā)現(xiàn)各組卵裂率之間差異不顯著；TSA處理組囊胚率高于對照組,36hTSA處理組與對照組差異極顯著(37.39±1.78％ vs.19.17±3.15％,P<0.01)與12h TSA處理組差異顯著(37.39±1.78％ vs23.98±4.84％,P<0.05),24h、48hTSA處理組與對照組差異顯著(35.11±4.47％ vs.19.17±3.1

8、5％,33.49±1.13％ vs.19.17±3.15％,P<0.05),其中36h TSA處理組囊胚率最高。 (5)在PZM3中添加不同濃度胰島素(0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)發(fā)現(xiàn)添加胰島素各組胚胎發(fā)育情況優(yōu)于對照組,2.5μg/ml組卵裂率最高,5μg/ml組其次,且這兩組與對照組差異極顯著(66.10±2.22％ vs. 64.78±2.82％ vs.49.48±4.91％

9、.P<0.01),10μg/ml組與對照組差異顯著(55.44±3.00％ vs.49.48±4.91％,P<0.05);試驗組囊胚率也高于對照組,其中5μg/ml組與對照組差異極顯著(34.42±3.42％ vs。27.75±1.44％,P<0.01)。 上述結(jié)果表明： ①NCSU-23作為豬卵母細胞成熟培養(yǎng)液效果最好,且促進成熟后激活胚胎發(fā)育至囊胚期,獲得較高的卵裂率和囊胚率。 ②添加Ghrelin對卵母細胞

10、成熟不利,同時也沒有顯著提高后期胚胎發(fā)育的能力。 ③在成熟液中添加5μg/ml胰島素能顯著提高卵母細胞成熟率及后期胚胎發(fā)育的卵裂率、囊胚率。 ④重構(gòu)胚胎經(jīng)24h-36 hTSA處理能夠促進重構(gòu)胚胎發(fā)育至囊胚期,獲得較高的囊胚發(fā)育率。 ⑤在胚胎培養(yǎng)液中添加胰島素對胚胎發(fā)育有促進作用,添加2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml能顯著提高卵裂率,添加5μg/ml能顯著提高囊胚率。 綜上所述,本研究初步搭