豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中SLBP基因表達(dá)和克隆.pdf

1、在卵子發(fā)生過(guò)程中,翻譯調(diào)節(jié)對(duì)調(diào)控基因表達(dá)起著關(guān)鍵作用。卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期合成和儲(chǔ)存的mRNA將在卵子成熟后期或胚胎發(fā)育早期被激活翻譯。在哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞中,編碼組蛋白的mRNA是含量最為豐富的mRNA之一,但是具體的翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚。其中復(fù)制依賴(lài)型組蛋白mRNAs的3’非翻譯區(qū)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),SLBP蛋白特異性地結(jié)合在莖環(huán)結(jié)構(gòu)上,對(duì)這些mRNAs的穩(wěn)定性和翻譯起著重要調(diào)控作用。這類(lèi)組蛋白的積累需要SLBP蛋白在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期表達(dá),并

2、在減數(shù)分裂成熟后期大量的積累。有鑒于此,本研究以豬SLBP基因?yàn)樨i卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的重要候選基因來(lái)研究豬SLBP基因在卵母細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律及基因結(jié)構(gòu)。
　　 1、卵母細(xì)胞體外成熟評(píng)價(jià)
　　 豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程的地衣紅染色核相分析。結(jié)果表明:從卵巢的直徑3～6mm卵泡中抽取的卵母細(xì)胞以GV期為主。體外成熟培養(yǎng)24h后,91.5％卵母細(xì)胞發(fā)生了生發(fā)泡破裂,當(dāng)體外成熟培養(yǎng)42h時(shí),可以使88.5％的卵母細(xì)胞完成第一次減數(shù)

3、分裂,停滯在第二次減數(shù)分裂中期。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞在0h時(shí)基本處于GV期,在24h基本發(fā)生GVBD,在42h基本發(fā)育到MII期。
　　 2、SLBP基因表達(dá)規(guī)律
　　 利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明:SLBP mRNA在0h、12h、24h、36h和42h收集的卵母細(xì)胞中mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.25、0.275、0.28、0.27和0.31,從卵母細(xì)胞GV期到MII期各個(gè)發(fā)育階段,SLBP mRNA

4、相對(duì)表達(dá)水平穩(wěn)定,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量無(wú)顯著差異.
　　 利用Western blot技術(shù)檢測(cè)豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中SLBP蛋白的變化:SLBP蛋白在0h的卵母細(xì)胞中就能檢測(cè)到,并且在0h、24h和42h卵母細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量分別為0.73、0.81和1.51,呈顯著上升趨勢(shì)。SLBP蛋白在豬MII期卵母細(xì)胞中表達(dá)量最高,與GV期和GVBD期相比,有極顯著差異(P<0.01)。通過(guò)與蛋白Maker進(jìn)行比較,測(cè)得豬SLBP蛋白表觀分子

5、量為41kDa,并且在42h時(shí),SLBP蛋白電泳遷移率發(fā)生了變化,推測(cè)SLBP蛋白發(fā)生磷酸化。
　　 3、SLBP的克隆和生物信息學(xué)分析
　　 本研究以人和牛等物種間SLBP的cDNA序列保守區(qū)為模板,設(shè)計(jì)五對(duì)引物,成功擴(kuò)增出豬SLBP基因大部分cDNA序列,長(zhǎng)度為1053bp,經(jīng)過(guò)NCBI-BLAST比對(duì)和物種間編碼區(qū)比對(duì),確定為該序列覆蓋了豬SLBP基因全部編碼區(qū)序列,編碼區(qū)全長(zhǎng)828bp,起始密碼子為ATG,終止密

6、碼子為T(mén)AA,編碼275個(gè)氨基酸殘基。在6種哺乳動(dòng)物中,豬與牛的SLBP基因編碼區(qū)序列的同源性(90.7％)最高,犬(82.73％)次之,順次為小鼠81.64％、大鼠81.16％、人80.64％和黑猩猩80.31％。并且通過(guò)序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)在豬SLBP mRNA3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)類(lèi)似于CPE結(jié)構(gòu)的序列。
　　 4、研究意義:
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SLBP基因表達(dá)在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中呈階段特異性,并且與卵母細(xì)胞成熟階段有

7、重要關(guān)聯(lián),卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期表達(dá)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物調(diào)控著卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育。這些母源信息負(fù)責(zé)完成減數(shù)分裂,完成成熟的卵母細(xì)胞重構(gòu)到全能胚胎細(xì)胞的全過(guò)程,驗(yàn)證了SLBP蛋白在卵母細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律不同于體細(xì)胞。通過(guò)對(duì)豬SLBP基因全部編碼區(qū)的克隆和測(cè)序,為卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量重要分子標(biāo)識(shí)的研究提供了新思路,從而為提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量,建立高效的豬體細(xì)胞核移植體系打下基礎(chǔ)。從宏觀上說(shuō),卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量提高必將使得體細(xì)胞克隆豬在人類(lèi)動(dòng)物疾病模型和異