L-肉堿對水牛卵母細胞體外成熟影響的研究.pdf

1、本研究以水牛為模型，通過探討L-肉堿L-carnitine對水牛卵母細胞體外成熟的影響，同時深入研究添加L-肉堿后卵母細胞脂質(zhì)代謝利用效率和抗氧化能力的變化情況，以進一步闡明L-肉堿影響卵母細胞成熟的作用機制。
　　首先，探討了L-肉堿對水牛卵母細胞體外成熟的影響。水牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)分別在添加有不同濃度的L-肉堿（1μg/mL，10μg/mL或100μg/mL）的成熟培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)24小時(h)后，分別統(tǒng)計

2、卵母細胞第一極體排出率，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與0μg/mL對照組相比，成熟液中添加1μg/mL或10μg/mL或100g/mL的L-肉堿，均能顯著提高卵母細胞第一極體排出率（64.44％±1.93％，66.17％±2.76％，63.27％±1.19％ vs56.60％±1.56％，P＜0.05），且1ug/mL組的囊胚率顯著高于對照組（34.37％±3.34％ vs21.62％±2.89％，P＜0.05）。采用實時熒光定量PCR的方法檢測卵母細胞

3、周圍的卵丘細胞中卵丘擴展相關(guān)基因ptx3、has2的表達量，結(jié)果顯示:添加了L-肉堿的各處理組卵丘細胞中has2的表達量均顯著高于0μg/mL對照組的表達量(P＜0.05)，其中以10μg/mL組的最高;各處理組ptx3的表達量與0μg/mL對照組相比，均有所增加，其中，10μg/mL和100μg/mL組的表達量均顯著高于0μg/mL對照組(P＜0.05)。
　　其次，探究了L-肉堿對水牛卵母細胞脂質(zhì)利用效率的影響。利用油紅O染色

4、法檢測水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中脂滴含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)水牛卵母細胞體外成熟過程中存在脂質(zhì)利用效率低的現(xiàn)象;而當水牛COCs分別在添加不同濃度L-肉堿（1μg/mL，10μg/mL或100μg/mL）的成熟培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)24 h后，卵母細胞中脂滴含量與0μg/mL對照組相比均顯著降低(P＜0.05)。通過酶聯(lián)免疫法測定卵母細胞中甘油三酯的含量發(fā)現(xiàn):添加10μg/mL或者100μg/mL的L-肉堿處理組的卵母細胞中甘油三酯的含量

5、極顯著低于0μg/mL對照組(2.601nM，2.113nM vs3.542nM，P＜0.01)。采用熒光定量PCR的方法分析卵母細胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因cpt1、atg1、hs1的表達量，結(jié)果顯示:添加L-肉堿各處理組的卵母細胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因cpt1a、atg1和hs1的表達量均有所增加，其中，1μg/mL組和10μg/mL組的cpt1a的表達量，10μg/mL組的atg1的表達量以及100μg/mL組的hs1的表達量均顯著高于0μ

6、g/mL對照組(P＜0.05)。
　　最后，探討了L-肉堿對水牛卵母細胞抗氧化能力的影響。采用酶聯(lián)免疫法測定水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)的含量變化，發(fā)現(xiàn)卵母細胞體外成熟過程中不斷地受到活性氧的脅迫作用;而當水牛卵母細胞體外成熟液中分別添加不同濃度L-肉堿(1μg/mL，10μg/mL或100μg/mL)，與0μg/mL對照組相比，均可以極顯著降低卵母細胞中MDA的含量(0.125797μM,0.125

7、2170μM,124155μM vs0.142609μM,P＜0.01)。通過檢測卵母細胞中的活性氧的含量也發(fā)現(xiàn)，添加L-肉堿各處理組（1μg/mL，10g/mL或100μg/mL）的卵母細胞中活性氧的含量顯著低于0μg/mL對照組(P＜0.05)。實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示:添加1μg/mL、10μg/mL或者100μg/mL的L-肉堿處理組的卵母細胞中抗過氧化基因gpx4的表達量均高于0μg/mL對照組，其中10μg/mL或者1