酪氨酸蛋白激酶在紫外線誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞PGE-,2-增加中的作用.pdf

1、白內(nèi)障是我國主要的致盲眼病。近年來,對(duì)于紫外線與白內(nèi)障關(guān)系的研究越來越引起廣泛的重視,國內(nèi)外許多流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)紫外線引起白內(nèi)障。長期慢性的紫外線輻射被認(rèn)為是老年性白內(nèi)障形成的主要因?yàn)?。但到目前為?紫外線輻射導(dǎo)致白內(nèi)障的機(jī)制仍然是眾說紛紜。
　　 老年性白內(nèi)障有三種主要類型:皮質(zhì)性、核性和后囊下渾濁。三種類型可能出現(xiàn)在同一個(gè)晶體上,但可能具有不同的危險(xiǎn)因素和病理改變。近年的流行病學(xué)調(diào)查將它們區(qū)分開來,部分地證實(shí)了皮

2、質(zhì)性和后囊下白內(nèi)障與紫外線輻射量呈正相關(guān),而核性白內(nèi)障與其無相關(guān)性。許多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也用紫外線照射動(dòng)物眼誘導(dǎo)產(chǎn)生了皮質(zhì)性和后囊下白內(nèi)障。
　　 研究表明紫外線照射活體兔晶體誘導(dǎo)產(chǎn)生皮質(zhì)性及后囊下白內(nèi)障的形成過程中伴有PGE2合成的增加,PGE2可能通過cAMP途徑調(diào)節(jié)晶體上皮細(xì)胞的DNA合成及細(xì)胞增值,進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生,而紫外線照射前應(yīng)用前列腺素合成酶抑制劑吲哚美辛可以部分地預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)生。
　　 對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行

3、紫外線照射的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),紫外線照射后PGE2合成增加的同時(shí)可以檢測(cè)到EGF-R(生長因子受體)酪氨酸蛋白激酶的磷酸化水平增高。應(yīng)用酪氨酸蛋白激酶抑制劑(Genistein)可以有效地抑制UV照射引起的PGE2合成及EGF-R酪氨酸蛋白激酶的磷酸化。H2O2可以產(chǎn)生與UV照射類似的PGE2合成及EGF-R酪氨酸蛋白激酶的磷酸化。
　　 鑒于此,我們建立了這樣一種假設(shè):紫外線照射引起晶體抗氧化機(jī)制的消耗,產(chǎn)生氧化損傷,氧化損傷通過酪

4、氨酸蛋白激酶(EGF-R)途徑啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),導(dǎo)致PGE2合成增加,進(jìn)而通過其可能的對(duì)DNA合成的調(diào)控作用,誘導(dǎo)白內(nèi)障的發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)用紫外線照射人晶體上皮細(xì)胞,將氧化劑(H2O2)、EGF-R激動(dòng)劑(EGF)和EGF-R抑制劑(Genistein)應(yīng)用于人晶體上皮細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞合成PGE2水平和酪氨酸蛋白激酶磷酸化水平的變化,探討酪氨酸蛋白激酶途徑在紫外線對(duì)晶體上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。
　　 方法:<

5、br>　　 本實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行。
　　 第一部分觀察酪氨酸蛋白激酶途徑在紫外線誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞PGE2合成過程中所起的作用。用紫外線照射人晶體上皮細(xì)胞,觀察其對(duì)人晶體上皮細(xì)胞合成PGE2的影響,照射前45'在培養(yǎng)液中加入前列腺素合成酶抑制劑Indomethacin(6 μg/ml),照射前30'在培養(yǎng)液中加入酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein(10 μg/ml),分別于作用后1h、2h、4h、6h用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的PGE

6、2濃度變化,作用后1h用Westernblotting和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)酪氨酸蛋白激酶磷酸化水平的變化。
　　 第二部分探討EGF-R酪氨酸蛋白激酶途徑在紫外線引起的晶體上皮細(xì)胞PGE2合成增加過程中的作用。用紫外線照射人晶體上皮細(xì)胞,照射前30'在培養(yǎng)液中加入酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein(10 μg/ml),照射后即刻在培養(yǎng)液中加入EGF(100ng/ml),同樣于作用后1h、2h、4h、6h用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的P

7、GE2濃度的變化,作用后1h用Westernblotting和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)EGF-R酪氨酸蛋白激酶磷酸化水平的變化。
　　 第三部分探討EGF-R-酪氨酸蛋白激酶途徑在晶體上皮細(xì)胞氧化損傷過程中的作用。用紫外線照射人晶體上皮細(xì)胞,照射前30'在培養(yǎng)液中加入酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein(10 μg/ml),照射后即刻在培養(yǎng)液中加入氧化劑H2O2(100mM),同樣于作用后1h、2h、4h、6h用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的P

8、GE2濃度的變化,作用后1h用Western blotting和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)EGF-R酪氨酸蛋白激酶磷酸化水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 一、氨酸蛋白激酶在UV引起HLEC PGE2合成增加中的作用紫外線照射后各時(shí)間段HLEC PGE2合成有明顯增加(空白組1h200.00±24.79、2h 253.65±45.65、4h 279.08±21.55、6h 255.59±43.84,UV照射組1h 613.37±

9、43.49、2h 452.93±87.37、4h 538.18±33.48、6h776.84±42.04),差異有顯著性(P<0.05)；吲哚美辛可以抑制紫外線的這種作用(Indo+UV組1h 93.25±10.76、2h 64.69±12.07、4h 117.18±17.49、6h 132.24±34.34),差異有顯著性(P<0.05)；紫外線照射前加入Genistein在各個(gè)不同時(shí)間段均能有效抑制UV引起的PGE2合成增加(Gen

10、+UV組1h 161.18±18.55、2h 240.35±24.98、4h 357.70±28.10、6h 478.60±62.38),差異有顯著性(P<0.05)。Western blotting及免疫組化結(jié)果表明在照射后60'出現(xiàn)170KD酪氨酸蛋白激酶最高水平的磷酸化增強(qiáng),吲哚美辛對(duì)170KD酪氨酸蛋白激酶的磷酸化無影響,Genistein抑制UV引起的酪氨酸蛋白激酶磷酸化增強(qiáng)。
　　 二、氨酸蛋白激酶在EGF及UV引起

11、的HLEC PGE2合成增加中的作用EGF可以產(chǎn)生與UV照射組相類似的PGE2的合成增加(EGF組1h 611.62±34.82、2h 397.13±52.36、4h 565.69±53.64、6h 781.45±87.32),與空白組對(duì)照差異有顯著性(P<0.05)；先給予紫外線照射后再加入EGF未能使PGE2合成進(jìn)一步增加(UV+EGF組1h 619.85±45.31、2h 408.94±33.97、4h 578.26±72.50、

12、6h 782.76±37.51),與UV照射組相比差異無顯著性(P>0.05)； 事先給予Genistein處理可以明顯抑制由EGF引起的PGE2升高(Gen+EGF組1h 200.67±23.19、2h 251.20±47.15、4h 354.42±27.66、6h 474.72±64.93),差異有顯著性(P<0.05)。Western blotting及免疫組化結(jié)果表明在UV組、EGF組、UV+EGF組均可以見到EGF-R的磷酸化

13、增強(qiáng),事先用Genistein處理組則未見到這種增強(qiáng)的磷酸化。
　　 三、酪氨酸蛋白激酶在H2O2誘導(dǎo)HLEC PEG2合成增加中的作用
　　 H2O2可引起細(xì)胞明顯的毒性反應(yīng)及PGE2合成明顯增強(qiáng)(H2O2組1h 602.57±45.29、2h 426.20±67.88、4h 486.84±41.99、6h 790.10±49.00),與空白組對(duì)照差異有顯著性(P<0.05),其增強(qiáng)程度與UV照射組無明顯差別(p>0.

14、05)；UV照射后再給予H2O2,未能進(jìn)一步增強(qiáng)PGE2合成(UV+H2O2組1h 623.81±22.15、2h 435.78±44.68、4h 505.49±50.55、6h 782.76±37.51),與UV照射組相比差異無顯著性(P>0.05)；加入H2O2前加入Genistein可以抑制H2O2引起的PGE2合成增強(qiáng)(Gen+H2O2組1h 286.58±22.91、2h 210.09±19.67、4h 150.07±14.5

15、1、6h184.19±17.68),差異有顯著性(P<0.05)。加入H2O2后可以見到與UV照射后相似的EGF-R磷酸化增強(qiáng)；兩種因素聯(lián)合與單一因素處理組EGF-R磷酸化增強(qiáng)程度相似；預(yù)先加入Genistein后用H2O2處理的細(xì)胞則未見EGF-R的磷酸化增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.UV照射結(jié)論:通過酪氨酸蛋白激酶途徑引起人晶體上皮細(xì)胞PGE2合成增加；
　　 2.EGF可以誘導(dǎo)HLEC的PGE2合成及EG

16、F-R磷酸化增加；UV照射后HLEC對(duì)EGF無反應(yīng)；UV通過EGF-R-酪氨酸蛋白激酶途徑誘導(dǎo)PGE2合成增加。
　　 3.H2O2通過EGF-R-酪氨酸蛋白激酶途徑誘導(dǎo)PGE2合成增加。結(jié)合相關(guān)的研究報(bào)告相,本實(shí)驗(yàn)提出了UV引起白內(nèi)障的一個(gè)可能途徑:UV照射引起晶體氧負(fù)荷增加,激活漿膜相關(guān)的Src酪氨酸蛋白激酶,導(dǎo)致EGF-R磷酸化,進(jìn)一步導(dǎo)致磷脂酶A2的磷酸化激活,產(chǎn)生PGE2合成的增加,通過對(duì)DNA合成的調(diào)控,進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)