中波紫外線和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶體上皮細(xì)胞中Ⅰ型膠原降解及EGF誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞移行的分子機(jī)制研究.pdf

1、白內(nèi)障是當(dāng)今社會(huì)首要的致盲眼病之一，現(xiàn)在世界上大約有2千萬人是由于白內(nèi)障而致盲，在我國白內(nèi)障也是引起失明的最主要的眼病，目前仍以手術(shù)為主要復(fù)明措施。但術(shù)后殘留的人晶體上皮細(xì)胞(HLECs)在晶體后囊增殖、移行，許多病人逐漸發(fā)生后囊膜混濁(PCO)或后發(fā)障(aftercataract)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，白內(nèi)障晶體摘除術(shù)后一年，約有12﹪的患者形成后發(fā)障，術(shù)后五年后發(fā)障的發(fā)病率約為28﹪，嚴(yán)重影響了手術(shù)預(yù)后。目前尚無有效的方法防治后發(fā)障。

2、現(xiàn)在已經(jīng)明確有許多因素導(dǎo)致白內(nèi)障和后發(fā)障的發(fā)生，如中波紫外線(UVB)、活性氧自由基(ROS)；在后發(fā)障的形成過程中，有多種生長因子參與了HLECs的增殖和分化，其中EGF、bFGF和TGF-β與此密切相關(guān)，可刺激HLECs產(chǎn)生ROS。在HLECs中的Ⅰ型膠原對(duì)細(xì)胞的增殖、移行、白內(nèi)障及后發(fā)障的形成起了關(guān)鍵的作用， HLECs的移行在后發(fā)障的發(fā)生中起著決定性的作用，但是目前有關(guān)細(xì)胞移行的信號(hào)機(jī)制研究不多。本研究探討了UVB、氧化

3、應(yīng)激誘導(dǎo)HLECs中Ⅰ型膠原降解和EGF誘導(dǎo)HLECs移行的分子機(jī)制。 研究分兩部分，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：一、UVB和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞中Ⅰ型膠原降解及抗氧化劑槲皮素(quercetin)的阻斷作用 方法：培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)，用UVB(15mJ/cm2)或H2O2(100μM)分別處理細(xì)胞，Westernblot法檢測不同時(shí)間段2、4、8、12、24h的Ⅰ型膠原表達(dá)，以及不同劑量的UVB(5、

4、10、15、20mJ/cm2)輻射或不同濃度H2O2(20、40、60、80、100μM)作用24h后Ⅰ型膠原表達(dá)；用UVB(30mJ/cm2)或H2O2(500μM)分別處理細(xì)胞，檢測不同時(shí)間(5min、15min、30min、1h、2h)中JNK和c-Jun的磷酸化，以及用不同劑量UVB(10、15、20、30、40mJ/cm2)或不同濃度H2O2(5、20、100、500μM)作用細(xì)胞1h后，檢測JNK和c-Jun的磷酸化；UVB

5、(30mJ/cm2)或H2O2(500μM)作用細(xì)胞后，不同時(shí)間段用Glatin酶譜法分析MMP1；不同濃度的抗氧化劑槲皮素預(yù)孵育HLECs1h后，再用UVB(30mJ/cm2)或H2O2(500μM)分別處理細(xì)胞，檢測JNK和c-Jun的磷酸化，以及Ⅰ型膠原。結(jié)果以均數(shù)±SD表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，p＜0.05表明差異有顯著性。 結(jié)果：在用UVB(15mJ/cm2)和H2O2(100μM)處理后，Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯的下

6、降，在8小時(shí)后為0.890，在24小時(shí)后為0.779。在用UVB(30mJ/cm2)和H2O2(500μM)處理后，MMP1的表達(dá)以時(shí)間依賴的方式增高。UVB和H2O2以時(shí)間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)的JNK1和c-Jun的磷酸化，槲皮素可通過時(shí)間和劑量的方式有效地阻斷UVB誘導(dǎo)的JNK2的磷酸化，但是卻對(duì)H2O2誘導(dǎo)的JNK2的磷酸化無效。在用UVB和H2O2處理后JNK1的磷酸化水平分別降到了0.724和0.763。在培養(yǎng)的HLECs中，

7、槲皮素通過劑量的方式也能阻斷UVB和H2O2誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原降解。 二、EGF通過ERK和P13K/AKT通路誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞移行 方法：培養(yǎng)HLECs，用不同濃度EGF(1，10，50，100和200ng/ml)孵育24h后，PhagokineticTrackMotility分析細(xì)胞的移動(dòng)性；EGF(100ng/ml)孵育細(xì)胞不同時(shí)間(5、15、30、60、120min)后，Westernblot法檢測磷酸化EGFR、

8、JNK，p38，ERK和AKT，并分別用PD153035(EGFRkinase抑制劑)、LY294002(PI3K/AKT抑制劑)或U0126(MEK/ERK抑制劑)預(yù)孵育細(xì)胞2h，100ng/ml的EGF處理5min，觀察上述指標(biāo)；EGF(100ng/ml)孵育細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、48h)后，用酶譜法分析MMP-2，并用PD153035、LY294002或U0126預(yù)孵育細(xì)胞2h，100ng/ml的EGF處理5min，檢測MMP

9、-2活性及細(xì)胞的移行。結(jié)果以均數(shù)±SD表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，p＜0.05表明差異有顯著性。 結(jié)果：EGF可誘導(dǎo)培養(yǎng)HLECs移行，并隨濃度增加細(xì)胞的移動(dòng)性有顯著性提高；EGF可誘導(dǎo)EGFR、JNK，p38，ERK和AKT磷酸化，EGFR抑制劑可阻斷EGF誘導(dǎo)的JNK、ERK和AKT磷酸化，但p38除外；EGF可顯著提高細(xì)胞中MMP-2的活性，并隨時(shí)間延長活性增強(qiáng)，PD153035、LY294002或U0126可抑制MM

10、P-2的活性以及細(xì)胞的移行。 結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)的HLECs中，UVB、H2O2通過時(shí)間和劑量的方式誘導(dǎo)JNK和c-Jun的磷酸化，導(dǎo)致MMPⅠ和Ⅰ型膠原表達(dá)，這一作用通路可被抗氧化劑槲皮素抑制，下調(diào)JNK和c-Jun的磷酸化的表達(dá)，阻斷Ⅰ型膠原降解。EGFR/ERK和EGFR/P13K/AKT通路介導(dǎo)了EGF刺激MMP-2的激活和體外培養(yǎng)HLECs的移行，這一通路可被EGFR抑制劑、P13K/AKT抑制劑、MEK/ERK