穿通支原體誘導小鼠膀胱移行上皮細胞癌實驗研究.pdf

1、目的： 本研究旨在建立穿通支原體(Mycoplasma penetrans，Mpe)誘導小鼠膀胱移行上皮細胞癌的模型，證實穿通支原體在哺乳動物體內誘導癌變的作用。 方法： 1.培養(yǎng)基：制備改良SP-4(用于Mpe的分離培養(yǎng))液體和固體培養(yǎng)基。 2.菌株來源： 標準菌株Mpe(GTU-54-6A1)由東南大學醫(yī)學院流行病學教研室趙季文教授惠贈。 W12(Mpe分離株)：由溫州醫(yī)學院附屬第一

2、醫(yī)院胃癌患者血清中分離出。 3.菌液的制備：將保存于-20℃的凍干菌株接種于2ml改良SP-4培養(yǎng)基中，置于37℃，5％ CO2孵箱中復蘇，待菌種至最佳生長期，取0.2ml菌液接種于1.8ml SP-4培養(yǎng)基中，以此方法傳3代，待支原體生長至對數期收集離心后的沉淀物，并每次進行菌落計數，備用。 4.實驗動物：6周齡清潔級健康ICR雌性小鼠84只，體重16-20 g，溫州醫(yī)學院動物實驗中心提供。 5.免疫抑制狀態(tài)小

3、鼠的制備：84只ICR小鼠隨機分為免疫抑制和非免疫抑制組(每組42只)。免疫抑制組隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺(50mg/kg/d，連續(xù)5次)制成免疫抑制小鼠模型。 6.分組： 6.1免疫抑制組：隨機取36只免疫抑制小鼠，其中9只灌胃方式感染Mpe，9只上行方式感染Mpe，9只灌胃方式感染W12，9只上行方式感染W12。 6.2非免疫抑制組：隨機取36只非免疫抑制小鼠，其中9只灌胃方式感染Mpe，9只上行方式感染Mpe，

4、9只灌胃方式感染W12，9只上行方式感染W12。 6.3 NS對照組：隨機取6只免疫抑制小鼠，3只灌胃方式注入NS，3只上行方式注入NS；隨機取6只非免疫抑制小鼠，3只灌胃方式注入NS，3只上行方式注入NS。 實驗各組在感染第4周，8周，18周后分批宰殺，無菌心臟取血后，順序取小鼠肝臟、肺臟、胃、小腸、大腸、膀胱等組織進行微生物學、病理組織學及形態(tài)學檢查。 7.實驗動物血培養(yǎng)及Mpe再培養(yǎng)。 8.光鏡觀察

5、各組小鼠臟器病理學改變。 9.選取光鏡觀察到細胞惡性轉化的標本及對照標本進行電鏡觀察。 10.統(tǒng)計學處理： 結果采用Fisher確切概率法做統(tǒng)計學分析。 結果： 1.肉眼觀察 小鼠解剖后，順序取小鼠肝臟、肺臟、胃、小腸、大腸、膀胱等組織，Mpe、W12感染組與NS對照組比較，小鼠各臟器形態(tài)上無明顯區(qū)別。 2.分離培養(yǎng) Mpe、W12感染組小鼠的血培養(yǎng)及組織培養(yǎng)均為支原體培

6、養(yǎng)陽性，NS對照組血培養(yǎng)及組織培養(yǎng)均為支原體培養(yǎng)陰性。Mpe、W12血液培養(yǎng)及組織培養(yǎng)均轉接種到固體培養(yǎng)基上，顯微鏡下觀察到支原體特征性“油煎蛋”樣菌落。 3.光鏡觀察 3.1 Mpe、W12上行感染組組感染4周、8周后，小鼠膀胱移行上皮細胞未出現(xiàn)明顯變化，其他組織細胞亦未見明顯變化； 3.2 Mpe、W12上行感染組感染18周后，小鼠膀胱移行上皮細胞排列紊亂，大小不一，核增大，而其他組織細胞未見明顯變化；

7、 3.3 Mpe、W12灌胃感染組感染4周、8周、18周后的小鼠各組織細胞均未見明顯變化； 3.4 NS對照組的小鼠上行感染組與灌胃感染組組織細胞均未見明顯變化。 4.電鏡觀察 4.1 Mpe、W12上行感染組感染18周后，小鼠膀胱移行上皮細胞均可見細胞膜溶解缺損，胞核不規(guī)則，核仁明顯，部分早期凋亡，胞漿內有空泡形成，內質網擴張明顯，且在腫瘤細胞內發(fā)現(xiàn)支原體。 4.2 Mpe、W12感染免疫抑制小鼠18

8、周后，小鼠膀胱移行上皮細胞惡性轉化程度高于非免疫抑制小鼠。 4.3 Mpe、W12上行感染組感染4周、8周后，小鼠各組織細胞未見惡性轉化。 4.4 Mpe、W12灌胃感染組感染4周、8周、18周后，小鼠各組織細胞未見惡性轉化。 5統(tǒng)計結果 5.1 Mpe、W12上行感染組和灌胃感染組在感染18周后膀胱移行上皮細胞癌變檢出率比較，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，Mpe、W12感染18周后上行感染方式感染的小鼠膀

9、胱移行上皮細胞癌變檢出率明顯高于灌胃方式感染。 5.2 Mpe、W12上行感染組在感染18周后膀胱移行上皮細胞癌變檢出率比較，P>0.05，無統(tǒng)計學意義，Mpe與W12誘導小鼠膀胱移行上皮細胞癌變的檢出率無差異。 5.3 Mpe、W12上行感染組在感染不同周數后膀胱移行上皮細胞癌變檢出率比較p<0.05，有統(tǒng)計學意義，支原體感染18周后的小鼠膀胱移行上皮細胞癌變檢出率明顯高于感染4周或8周后的小鼠。 結論：