Substance P抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡的體外實驗研究.pdf

1、目的:
　　體外培養(yǎng)小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)，建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡模型，通過添加substance P(SP)，研究SP對高糖環(huán)境下小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，并分析可能的信號通路。
　　方法:
　　1.高糖誘導(dǎo)小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡模型的建立:應(yīng)用小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)作為體外細(xì)胞實驗的模型，在KSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)TKE2細(xì)胞，行如下實驗:
　　(1)高糖誘導(dǎo)TKE

2、2細(xì)胞凋亡的濃度梯度:TKE2細(xì)胞分別采用0、50、150、250、350 mM葡萄糖處理24h，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡比例，確定高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的最適葡萄糖濃度。
　　(2)高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的時間梯度:根據(jù)(1)中結(jié)果選定最適高糖濃度，分別處理TKE2細(xì)胞0、12、24、48 h，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡比例，確定高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的

3、最適時間。
　　2.SP抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡模型的建立:在方法1結(jié)果建立的高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡模型中分別添加0.1、1、10μM SP進(jìn)行預(yù)處理2h，采用Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，確定SP對TKE2細(xì)胞凋亡的影響及其最佳濃度。
　　3.探討SP抑制細(xì)胞凋亡可能的信號通路:根據(jù)方法1和2中結(jié)果確定高糖濃度、SP濃度及處理時間，分析SP抑制細(xì)胞凋亡可能的信號通路:
　　(1)與NK-1R信號

4、通路的關(guān)系:在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過添加NK-1R抑制劑L-733，060(1μM)預(yù)處理，而后通過Annexin V/PI雙染、Caspase活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況;
　　(2)與Akt信號通路的關(guān)系:在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過添加Akt抑制劑(40μM)預(yù)處理，而后行Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測P-Akt、總Akt的表達(dá)。
　　(3)與氧化應(yīng)激通路的關(guān)系:在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，高

5、糖組中分別添加NAC(1 mM)和DPI(1μM)兩種陽性抗氧化劑預(yù)處理，與SP組平行實驗，而后行ROS染色、鈣離子熒光探針(Fluo-3AM)染色和線粒體膜電位熒光探針(JC-1)染色檢測分析細(xì)胞活性氧水平、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和線粒體膜電位變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.HG可誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，以晚期凋亡為主，具有濃度和時間依賴性。當(dāng)葡萄糖濃度分別為0、50、150、250、350 mM時，TKE2細(xì)胞凋亡比例分

6、別為5.60％、4.87％、7.97％、44.62％、95.51％。當(dāng)用相同濃度葡萄糖分別處理0、12、24、48h時，各組細(xì)胞凋亡比例分別為6.33％、13.94％、45.11％、66.99％。當(dāng)葡萄糖濃度為250mM、處理時間為24 h時，TKE2細(xì)胞凋亡模型最理想。
　　2.SP可抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡，存在濃度依賴性。當(dāng)SP濃度分別為0、0.1、1、10μM時，TKE2細(xì)胞凋亡比例分別為44.53％、30.23％、

7、16.95％、21.41％。當(dāng)SP濃度為1μM時，其抑制細(xì)胞凋亡的作用最顯著。
　　3.SP發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡可能的信號通路:
　　(1) SP-NK-1R信號通路:向SP組中加入NK-1R抑制劑L-733，060(1μM)后，流式分析結(jié)果示HG、HG+SP、HG+SP+NK-1R抑制劑組細(xì)胞凋亡比例分別為33.78％、15.68％、34.32％，加入NK-1R抑制劑組細(xì)胞凋亡比例較SP組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

8、1)。caspase3、8、9活性檢測結(jié)果示:SP組與高糖組相比caspase3、8、9表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，SP組中加入Nk-1Ri，caspase8、9表達(dá)與SP組無明顯差異(P＞0.05)，caspase3表達(dá)明顯升高，與高糖組無差異(P＞0.05)。
　　(2) Akt信號通路:向SP組中加入Akt抑制劑(40μM)后，流式分析結(jié)果示HG、HG+SP、HG+SP+Akt抑制劑組細(xì)胞凋亡比例分別為

9、46.70％、15.39％、29.43％，加入Akt抑制劑后，細(xì)胞凋亡比例明顯高于SP組，但仍低于高糖組，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Western Blot結(jié)果示:高糖組、NK-1R抑制劑組及AKt抑制劑組P-Akt表達(dá)水平較對照組及SP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，SP組與對照組無差異(P＞0.05)。各組總Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)
　　(3)氧化應(yīng)激相關(guān)通路:高糖處理組中分別加

10、入抗氧化劑NAC和DPI，SP組、NAC組、DPI組與高糖組相比，ROS表達(dá)減弱、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，線粒體膜電位升高，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。高糖組、NK-1Ri組、Akti組三組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2）細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。SP可以抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡。SP抑制細(xì)胞凋亡的作用與其通過NK-1R受體，激活A(yù)