沉默信號調(diào)控因子1蛋白促進高糖環(huán)境下角膜上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、第一部分沉默信號調(diào)控因子1(Sirt1)在1型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達
　　 目的:探討沉默信號調(diào)控因子(Sirt1)在1型糖尿病模型C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達，為明確Sirt1與糖尿病性角膜病變的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:取雄性C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠與同窩出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2+/+小鼠各8只，分別作為1型糖尿病模型組和

2、正常對照組。分別于24周齡、28周齡、32周齡、36周齡、40周齡、44周齡、48周齡測量兩組小鼠的體重、血糖、淚液分泌情況，同時行虎紅染色觀察淚膜及上皮情況;于48周齡時頸椎脫臼法處死，取小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)和角膜組織。采用蘇木素-伊紅染色顯示兩組小鼠的角膜和三叉神經(jīng)節(jié)的組織病理學(xué)變化;行免疫組織化學(xué)法檢測角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中Sirt1蛋白的表達和定位;行熒光定量PCR法檢測Sirt1 mRNA在角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達;行Western

3、blot檢測兩組小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中Sirt1蛋白的相對表達量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:與C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠相比，C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的體重明顯較輕（t=22.784，P=0.000），淚液分泌減少（t=10.693，P=0.000），虎紅染色著色明顯。C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大小不均勻，排列較疏松，神經(jīng)纖維排列較散亂，角膜上皮變薄、細(xì)胞

4、層數(shù)減少;而C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大小、形態(tài)較為均一，排列緊密、整齊，神經(jīng)纖維排列較整齊。熒光定量PCR顯示，SirtlmRNA在C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜的表達強度顯著低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠（0.53±0.08vs.0.97±0.12），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.863，P=0.003）;在C57BL/6-Ins2kita+/J小鼠三叉神經(jīng)節(jié)的表達灰度為2.43

5、±0.19，低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠（2.50±0.23），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.582，P=0.611）。Western blot顯示，C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜中Sirt1蛋白的表達明顯低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠（0.778±0.017vs.1.306±0.014），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=33.141，P=0.001）;但Sirt1蛋白在兩組小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中的表達差

6、異無統(tǒng)計學(xué)意義（1.100±0.016 vs.1.108±0.018，t=0.431，P=0.708）。
　　 結(jié)論:Sirt1在48周齡1型糖尿病C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜中的表達降低，提示Sirt1有可能參與糖尿病性角膜病變。
　　 第二部分過量表達Sirt1蛋白對高糖環(huán)境下角膜上皮損傷修復(fù)的影響
　　 目的:研究Sirt1對高糖環(huán)境下角膜上皮損傷修復(fù)的影響及其作用機制。
　　

7、 方法:取雄性C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠20只與同窩出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠5只分成五組:C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠角膜損傷不處理組、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷不處理組、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結(jié)膜下注射生理鹽水組(10uL)、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結(jié)膜下注射Ad-GFP組（10uL滴度為1

8、011的重組GFP腺病毒）和C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結(jié)膜下注射Ad-Sirt1組（10uL滴度為1011的重組Sirt1腺病毒）。角膜上皮刮除后，立即結(jié)膜下注射相應(yīng)物質(zhì)。損傷48h后，通過Western blot分別比較前兩組之間、后四組之間小鼠角膜組織中乙?；痯53、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3蛋白）、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)、乙?；牡鞍准っ窧（p-AKT）等蛋白的表達量，進而顯

9、示過量表達Sirt1對C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜組織中p53、IGFBP3/IGF-1/AKT的表達的影響。通過熒光素鈉染色并分別于傷后0h、24h、48h裂隙等下觀察并照相顯示過量表達Sirt1對糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù)的影響。
　　 結(jié)果:糖尿病小鼠角膜上皮刮除后，熒光素鈉染色結(jié)果表明結(jié)膜下注射重組SIRT1腺病毒的糖尿病小鼠48小時后角膜上皮損傷愈合的面積顯著低于未進行SIRT1腺病毒注射組，說明過

10、量表達Sirt1后促進了糖尿病小鼠角膜的損傷修復(fù)。與野生型小鼠相比，糖尿病小鼠的角膜組織中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表達明顯上調(diào)，而Sirt1、IGF-1R、p-AKT顯著下調(diào)。結(jié)膜下注射重組SIRT1腺病毒的C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜組織中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表達較未注射時顯著下調(diào)，而IGF-1R、乙?；疉TK蛋白表達顯著增加，其表達量均與野生型小鼠相當(dāng)。
　　 結(jié)論:Sirt1通過抑制p