胰腺星狀細(xì)胞促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分:胰腺星狀細(xì)胞促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷
　　目的：近期研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病(T2DM)患者和動(dòng)物模型的胰島中存在活化的胰腺星狀細(xì)胞(PSC)。PSC在一些胰腺疾病如慢性胰腺炎和胰腺癌中的致胰腺纖維化作用已被大量研究證實(shí)，但其在胰腺內(nèi)分泌所起作用尚未明確。本研究擬通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)來觀察PSC對(duì)胰島β細(xì)胞功能及活力的影響。
　　方法：常規(guī)胰腺組織塊培養(yǎng)法分離wistar大鼠PSC

2、，體外培養(yǎng)純化至4-5代后，通過胰腺多點(diǎn)移植的方式植入正常血糖的wistar和自發(fā)性T2DM Goto-Kakizaki(GK)大鼠體內(nèi)。未干預(yù)組和假手術(shù)組作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組(wistar大鼠未干預(yù)組、假手術(shù)組及移植組分別記為WU、WS、WT;GK大鼠未干預(yù)組、假手術(shù)組及移植組記為GU、GS、GT)。移植后密切監(jiān)測(cè)血糖，移植16周后口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)檢測(cè)各組大鼠血糖和葡萄糖刺激的胰島素釋放水平，并計(jì)算血糖和胰島素曲線下面積。糖化

3、血紅蛋白(HbA1c)試紙檢測(cè)HbA1c水平;胰腺組織切片行胰島素免疫熒光染色觀察胰島形態(tài)并比較胰島β細(xì)胞量;TUNEL和胰島素免疫熒光共染觀察胰島β細(xì)胞凋亡;馬松染色評(píng)估胰島纖維化。
　　結(jié)果：1.大鼠隨機(jī)分組后監(jiān)測(cè)基線水平胰島功能，wistar大鼠三組間和GK大鼠三組間OGTT各點(diǎn)血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植16周后OGTT示GK大鼠糖負(fù)荷后30min血糖明顯升高(GT:30.1±4.5 mmol/l vs.GU:22.4±4.1

4、 mmol/l和GS:23.2±1.9 mmol/l，P＜0.05)，血糖曲線下面積增多(GT:2953.2±296.1 mmol/l·min vs.GU:2474.4±374.1 mmol/l·min和GS:2525.4±273.3 mmol/l·min，P＜0.05);空腹及糖負(fù)荷30 min血漿胰島素水平下降(0min:GT:54.0±21.1 pg/ml vs.GU:94.8±73.8 pg/ml和GS:126.5±37.1 p

5、g/ml,P＜0.05;30min:GT:85.7±49.5 pg/ml vs.GU:128.7±74.3 pg/ml和GS:91.6±30.5 pg/ml,P＜0.01)，相應(yīng)的胰島素曲線下面積下降(GT:8259.2±2345.8 pg/ml·min vs.GU:21364.9±8173.4 pg/ml·min和GS:19245.7±4191.9 pg/ml·min，P＜0.05)，GK大鼠移植組HbA1c升高(GT:9.8±1.4

6、％vs.GU:8.8±1.0％和GS:8.5±1.0％，P＜0.05)。2.免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSC移植后GK大鼠胰島形態(tài)受損更為嚴(yán)重，β細(xì)胞量減少(GT:0.09±0.03 vs.GU:0.13±0.05和GS:0.12±0.06，P＜0.05)，胰島纖維化增加(GT:0.30-±0.07 vs.GU:0.22±0.08和GS:0.23±0.04，P＜0.05)。3.PSC移植后wistar大鼠WT、WU及WS三組間血糖、胰島素及相

7、應(yīng)的曲線下面積、HbA1c、胰島β細(xì)胞量及胰島纖維化程度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：PSC移植導(dǎo)致GK大鼠血糖及HbA1c水平升高，胰島素釋放降低，胰島β細(xì)胞量減少，胰島纖維化及β細(xì)胞凋亡增加，表明PSC移植進(jìn)一步加重了GK大鼠胰島β細(xì)胞功能損傷，而wistar大鼠移植后未產(chǎn)生顯著影響。體外高糖和PSC上清降低INS-1細(xì)胞活力，增加凋亡，增加CHOP的表達(dá)，提示PSC可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步加重高糖對(duì)β細(xì)胞損傷。
　　第二

8、部分:大鼠胰島星狀細(xì)胞對(duì)胰島β細(xì)胞的影響
　　目的：大量研究已經(jīng)證實(shí)慢性胰腺炎、胰腺癌等疾病中出現(xiàn)的胰腺纖維化是由胰腺星狀細(xì)胞(PSC)引起，但是2型糖尿病病程晚期出現(xiàn)的胰島纖維化細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚未完全明確。本研究應(yīng)用改良的PSC的分離技術(shù)，從正常大鼠胰島內(nèi)分離星狀細(xì)胞(ISC)，并對(duì)其生物學(xué)特性加以鑒定，檢測(cè)其對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響
　　方法：胰腺組織外生培養(yǎng)技術(shù)常規(guī)分離PSC作為對(duì)照，本研究嘗試采用胰島貼壁培養(yǎng)法分離ISC，

9、油紅O及免疫熒光染色分別觀察脂滴和平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-SMA)的表達(dá)來評(píng)估細(xì)胞活化狀態(tài)，α-SMA、波形蛋白(vimentin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)用來鑒定ISC，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維(col-Ⅰ、col-Ⅲ)和纖維連接蛋白(FN)表達(dá)。CCK-8、劃痕試驗(yàn)和transwell小室試驗(yàn)分別用來比較PSC和ISC在增殖、遷移能力的差別。通過非接觸式共培養(yǎng)及ISC-上清(ISC-CM)協(xié)同高糖

10、(25mmol/l)干預(yù)INS-1細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察ISC及高糖對(duì)INS-1細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果：在細(xì)胞培養(yǎng)皿經(jīng)過培養(yǎng)24 h后，胰島貼壁，48 h內(nèi)可見外形呈現(xiàn)多角形如星狀的細(xì)胞自胰島邊緣外生。和靜息狀態(tài)PSC同步比較，ISC脂滴含量明顯量少，且快速消失，隨之表達(dá)α-SMA。傳代活化后的ISC表達(dá)PSC的鑒定指標(biāo)α-SMA、vimentin和GFAP，并且表達(dá)col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN，為了和PSC區(qū)別，暫時(shí)將此類

11、細(xì)胞稱為胰島星狀細(xì)胞。體外培養(yǎng)12h、36h及72h后CCK-8實(shí)驗(yàn)各組OD值示ISC增殖能力明顯弱于PSC(0.15±0.01、0.30±0.01、0.44±0.01 vs.0.15±0.01、0.25±0.02、0.37±0.02;12h, p＞0.05,余p＜0.01)，劃痕實(shí)驗(yàn)示24h后ISC遷移入無細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞量明顯少于PSC(33.8±7.9vs.129.2±8.8，p＜0.01)，transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)示24h后

12、穿過小室膜的ISC少于PSC(21.2±5.1 vs.50.0±10.2，p＜0.01)。INS-1細(xì)胞經(jīng)ISC非接觸式共培養(yǎng)及ISC-CM干預(yù)后CCK-8檢測(cè)OD值降低，提示細(xì)胞活力下降，而在高糖共同干預(yù)下，破壞效應(yīng)最為明顯。通過脫細(xì)胞技術(shù)分離大鼠ISC-ECM，干預(yù)INS-1細(xì)胞24h后caspase-3活性檢測(cè)OD值增加(339074.6±49799.2 vs.104809.1±2837.6，p＜0.01)，ECM與胰島共培養(yǎng)后胰

13、島形態(tài)破壞，F(xiàn)DA/PI染色示幾乎100％細(xì)胞呈現(xiàn)PI陽性細(xì)胞。
　　結(jié)論：本次實(shí)驗(yàn)成功從新鮮分離的大鼠胰島提取出星狀細(xì)胞，這類ISC具有靜息和活化兩種狀態(tài)，活化狀態(tài)ISC可表達(dá)α-SMA、vimentin及GFAP，合成細(xì)胞外基質(zhì)，具有星狀細(xì)胞基本特性。但是其增殖和遷移能力明顯弱于PSC。ISC可誘導(dǎo)胰島細(xì)胞功能及細(xì)胞活力下降，尤其在高糖參與下?lián)p傷效應(yīng)更明顯，進(jìn)一步分離的ISC-ECM可顯著導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損。
　　第三部分

14、:人胰島星狀細(xì)胞對(duì)胰島功能的影響
　　目的：前期研究從新鮮分離的大鼠胰島中成功分離了胰島星狀細(xì)胞(ISC)，這些細(xì)胞與經(jīng)典的胰腺星狀細(xì)胞(PSC)表型類似，可能參與2型糖尿病(T2DM)胰島纖維化的發(fā)生。由于人和大鼠間存在種屬差異，本研究將進(jìn)一步嘗試從人胰島中分離星狀細(xì)胞，并觀察人ISC對(duì)胰島功能的影響。
　　方法：通過標(biāo)準(zhǔn)的組織塊外生培養(yǎng)技術(shù)，我們從新鮮分離的人胰島中成功分離出ISC，同時(shí)，從人胰腺組織塊中分離了胰腺星狀細(xì)

15、胞(PSC)作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。平滑肌激動(dòng)蛋白-α(α-SMA)、結(jié)蛋白(desmin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色鑒定人ISC，CCK-8試驗(yàn)用來比較人ISC和PSC增殖速度差異，劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell小室遷移試驗(yàn)用來比較ISC和PSC的遷移能力，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及纖維連接蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN)免疫熒光染色觀察ISC分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力。為了觀察人ISC對(duì)胰島功能

16、及細(xì)胞活力的影響，我們將新鮮分離的人胰島與體外培養(yǎng)活化后的ISC接觸式共培養(yǎng)，葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)檢測(cè)胰島素釋放功能，caspase-3活性試劑盒檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步脫細(xì)胞技術(shù)分離人ISC-ECM干預(yù)人胰島，F(xiàn)DA/PI雙染觀察胰島細(xì)胞活力。
　　結(jié)果：貼壁培養(yǎng)的人胰島外生細(xì)胞眾多星狀細(xì)胞，傳代活化人ISC免疫熒光可見α-SMA、desmin、vimentin、GFAP染色，表達(dá)col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN。與PSC相比，

17、人ISC增殖顯著降低(24h、48h及72h三點(diǎn)CCK-8實(shí)驗(yàn)所測(cè)OD值:ISC0.63±0.01、0.80±0.01及0.99±0.02 vs.0.65±0.05、1.03±0.02及1.40±0.01，24h點(diǎn)兩組p＞0.05，余對(duì)比p＜0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)示ISC24h后遷移入無細(xì)胞區(qū)的細(xì)胞量較PSC明顯減少(19.0±5.5 vs.51.8±10.2，p＜0.01)，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)示24h后ISC穿膜的細(xì)胞數(shù)較P