白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)SIRT1緩解高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞損傷.pdf

1、研究背景與研究目的
　　糖尿病腎病(DN)作為糖尿病的微血管并發(fā)癥之一是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的一個(gè)主要病因。許多致病因素造成DN的發(fā)生與發(fā)展。腎小球損傷，尤其是系膜細(xì)胞增生以及腎小球內(nèi)高壓是DN的主要病理特點(diǎn)，然而許多臨床研究和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究表明腎小管上皮細(xì)胞損傷與腎功能降低有密切關(guān)系，并作為評(píng)估DN預(yù)后的指標(biāo)之一。因此探究腎小管上皮細(xì)胞損傷在DN發(fā)病機(jī)制中的作用并尋找可早期防治的藥物是十分必要的。
　　氧化應(yīng)激是指

2、自由基的產(chǎn)生和抗氧化物質(zhì)抵御之間的不平衡，從而導(dǎo)致組織損傷。很多研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制過程中有非常重要的作用。近年來，關(guān)于又頭框蛋白O3a(FOXO3a)在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注。FOXO3a是叉頭框蛋白(FOXO)家族中的一員，在老化，細(xì)胞代謝，胰島素抵抗和抑制氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)FOXO3a可以調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化物質(zhì)。許多研究表明FOXO3a在急

3、性腎損傷、DN等多種腎臟疾病中起著重要的作用。
　　細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡的一種方式，參與腎臟生理學(xué)重塑，使腎臟細(xì)胞減少，結(jié)構(gòu)改變。糖尿病病人和鏈脲佐霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中都表現(xiàn)出近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。P53是一種腫瘤抑制基因，研究表明包括DN在內(nèi)的多種腎臟病中P53的表達(dá)是增高的。P53可以增加足細(xì)胞，系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致腎臟損傷。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sir2)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

4、(NAD+)依賴的脫乙?；?，目前哺乳類動(dòng)物Sir2中發(fā)現(xiàn)7種沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRTs），目前為止SIRT1被認(rèn)為是與人類Sir2直接同源并且是研究最多的Sir2。SIRT1可以通過其脫乙?；钚哉{(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，SIRT1不僅可以脫乙?；M蛋白并且可以脫乙?；墙M蛋白，比如FOXO、P53、NF-KB、PGC-1a、PARP、Ku70等。SIRT1在凋亡反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明SIRT1通過與FOXO3a

5、直接結(jié)合并脫乙?；疐OXO3a，調(diào)節(jié)FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性，降低氧化應(yīng)激損傷。然而，SIRT1/FOXO3a在高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激方面的作用目前研究較少。許多研究還發(fā)現(xiàn)SIRT1通過去乙?；疨53蛋白第382位的賴氨酸殘基來抑制P53的活性，從而降低P53對(duì)其下游靶基因的激活作用，減少細(xì)胞凋亡。故在防治DN發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程中SIRT1可以作為新的作用靶點(diǎn)。
　　白藜蘆醇(RSV)作為SIRT1激動(dòng)劑被人們熟知，是一種

6、天然的多元酚類物質(zhì)，在葡萄皮中含量豐富，具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用，如抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌、心血管保護(hù)作用等，為許多疾病提供了有效的治療方法。但是RSV抑制或延緩糖尿病相關(guān)的腎小管氧化應(yīng)激和凋亡的具體機(jī)制并不明確。
　　據(jù)上所述，我們提出以下假說:高糖可以導(dǎo)致SIRT1的表達(dá)降低，在糖尿病大鼠腎臟中，SIRT1的減少可以通過增加乙?；疐OXO3a和乙?；疨53的表達(dá)水平而引發(fā)一系列氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)，而白藜蘆醇治療可以通

7、過增加SIRT1表達(dá)及其脫乙?；钚远种埔阴；疐OXO3a和乙?；疨53的表達(dá)水平，從而抑制由高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)。為驗(yàn)證以上假說，我們將首先檢測(cè)糖尿病大鼠腎臟中的SIRT1及其脫乙?；钚?、FOXO3a及乙?；疐OXO3a蛋白表達(dá)水平、P53及乙酰化P53蛋白表達(dá)水平、各氧化應(yīng)激因子和凋亡因子的變化，然后利用體外高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）尋找上述指標(biāo)變化的機(jī)制。
　　研究方法
　　我們分別用體內(nèi)實(shí)

8、驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠腎組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。采用STZ(60 mg/kg)誘導(dǎo)的大鼠作為糖尿病動(dòng)物模型，動(dòng)物隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組，糖尿病組，糖尿病+白藜蘆醇組(30mg·kg-1·d-1)。治療16周后，留尿、稱重、抽血、取腎用于后續(xù)分析;HK-2細(xì)胞給予白藜蘆醇(25μM)預(yù)刺激2h后，加入高糖(30 mM)刺激72 h。為了進(jìn)一步研究SIRT1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用，我們采用了

9、SIRT1 siRNA或CON siRNA轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中，利用westernblot和RT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率后，將轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在高糖環(huán)境中加入或不加入白藜蘆醇（25μM）培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)大鼠腎重/體重、空腹血糖和內(nèi)生肌酐清除率;大鼠腎臟糖原沉積及纖維化情況采用PAS、masson染色評(píng)估;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠腎臟中SIRT1的表達(dá);特異的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞中的S

10、IRT1脫乙?；钚?、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;western blot方法檢測(cè)大鼠腎臟組織和HK-2細(xì)胞中SIRT1、FOXO3a、過氧化氫酶(CAT)的蛋白表達(dá);免疫共沉淀反應(yīng)檢測(cè)大鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞乙?；疐OXO3a的蛋白表達(dá)。
　　為明確白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠腎組織凋亡反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制，糖尿病大鼠成模采用一次性腹腔內(nèi)注射STZ(60 mg/kg)，動(dòng)物隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組，糖尿病組，

11、糖尿病+白藜蘆醇組（30 mg·kg-1·d-1）。治療16周后，稱重、抽血、取腎用于后續(xù)分析;HK-2細(xì)胞分別給予高糖刺激0h，24 h，48 h，72 h檢測(cè)高糖誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)凋亡的影響。白藜蘆醇(25μM)預(yù)刺激2h后，給予高糖(30 mM)刺激72 h，驗(yàn)證白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)的影響。為了進(jìn)一步研究SIRT1在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡中的作用，我們采用了SIRT1siRNA或CON siRNA轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中

12、，利用western blot和RT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率后，將轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在高糖環(huán)境中加入或不加入白藜蘆醇（25μM）培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)大鼠腎重/體重、空腹血糖、血肌酐和尿素氮;大鼠腎臟糖原沉積及纖維化情況采用PAS、masson染色評(píng)估;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠腎臟中SIRT1的表達(dá);特異性試劑盒檢測(cè)SIR1脫乙?；钚?、caspase-3活性、caspase-9活性;JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位梯度;H

13、oecst33258染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài);western blot方法檢測(cè)大鼠腎臟組織和HK-2細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved PARP、SIRT1、P53和乙?；疨53的蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果
　　1.白藜蘆醇通過增加SIRT1脫乙?；疐OXO3a改善糖尿病大鼠腎臟的氧化應(yīng)激損傷
　　1.1白藜蘆醇改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)及腎臟纖維化等病理異常
　　與糖尿病(DM)組相比，白藜蘆醇治療后

14、空腹血糖無明顯改善，腎重/體重顯著降低，肌酐清除率顯著上升，白藜蘆醇治療組大鼠腎臟糖原沉積明顯減少。與DM組相比，白藜蘆醇治療組的腎小球硬化明顯改善。Masson染色結(jié)果表明糖尿病大鼠腎臟纖維化程度可通過白藜蘆醇治療顯著改善。
　　1.2白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠腎臟SIRT1表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示DM組大鼠腎臟組織中SIRT1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少，白藜蘆醇治療后明顯增多。白藜蘆醇治療糖尿病大鼠

15、后其腎組織中SOD活性較DM組明顯增多、MDA含量明顯減少。Western blot結(jié)果顯示白藜蘆醇治療組糖尿病大鼠腎臟組織中SIRT1、CAT蛋白表達(dá)較DM組明顯增加，但是FOXO3a的蛋白水平?jīng)]有變化。白藜蘆醇治療糖尿病大鼠后其腎組織SIRT1脫乙酰化活性較DM組明顯增加。同時(shí)IP結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療組大鼠腎臟組織中乙酰化FOXO3a的蛋白表達(dá)較DM組明顯下降。
　　1.3白藜蘆醇緩解高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷并增

16、加SIRT1的脫乙酰化活性
　　與高糖(HG)組相比，白藜蘆醇干預(yù)可以緩解高糖導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞中SOD的減少和MDA、ROS的增加。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)組HK-2細(xì)胞中SIRT1和CAT的蛋白表達(dá)較HG組明顯上升，但FOXO3a的蛋白表達(dá)沒有變化。高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中SIRT1脫乙?；钚悦黠@降低，但是白藜蘆醇干預(yù)可以緩解這一變化。同時(shí)IP結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中乙?；疐OXO3a的蛋白水

17、平比低糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中高，并且白藜蘆醇可以降低高糖導(dǎo)致的這一高水平乙?；疐OXO3a表達(dá)。同時(shí)結(jié)果還顯示滲透壓并不影響上述氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)。
　　1.4 SIRT1對(duì)高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激的影響
　　SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染后使HK-2細(xì)胞內(nèi)源性SIRT1的蛋白表達(dá)及基因水平均減少65％。CON siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，白藜蘆醇干預(yù)可以顯著改善高糖引起的SOD減少，MDA、ROS和乙酰化FOXO3

18、a的增多。與CON siRNA轉(zhuǎn)染相比，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞顯示出SOD明顯減少、MDA、ROS和乙?；疐OXO3a明顯增多，但是SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，白藜蘆醇干預(yù)并不能改善高糖引起的以上氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。
　　2.白藜蘆醇通過調(diào)控SIRT1/P53緩解糖尿病大鼠腎臟的凋亡反應(yīng)
　　2.1白藜蘆醇改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)及腎臟纖維化等病理異常
　　與DM組相比，白藜蘆醇治療后空腹

19、血糖、血肌酐、尿素氮無明顯改善，腎重/體重明顯下降。PAS染色顯示白藜蘆醇治療組大鼠腎臟糖原沉積較DM組明顯減少。與DM組相比，白藜蘆醇治療組的腎小球硬化明顯改善。Masson染色結(jié)果表明白藜蘆醇治療可顯著改善糖尿病大鼠腎臟纖維化程度。
　　2.2白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠腎臟SIRT1表達(dá)及凋亡指標(biāo)的影響
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及western blot結(jié)果示DM組大鼠腎臟組織中SIRT1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少。與正常對(duì)照

20、組相比，DM組大鼠腎臟組織中caspase-3及caspase-9活性均明顯增加。Western blot結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，DM組cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白顯著增多，白藜蘆醇治療后上述指標(biāo)均能明顯改善。
　　2.3白藜蘆醇使糖尿病大鼠腎組織中SIRT1的脫乙?；钚栽黾硬⒛芙档鸵阴；疨53的蛋白表達(dá)
　　白藜蘆醇治療糖尿病大鼠后其腎組織SIRT1脫乙?；钚暂^DM組明顯增加。同

21、時(shí)western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療組大鼠腎臟組織中乙酰化P53的蛋白表達(dá)較DM組明顯下降。
　　2.4高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡反應(yīng)及SIRT1的脫乙酰化活性的影響
　　與高糖刺激0 h(HG0h)相比，高糖刺激72h后HK-2細(xì)胞中MTT結(jié)果表現(xiàn)出細(xì)胞存活率顯著降低、JC-1染色結(jié)果顯示線粒體膜電位顯著降低、Hoechst33258染色結(jié)果顯示細(xì)胞核分裂顯著增加。高糖刺激48 h、72 h后，HK-2細(xì)胞的cas

22、pase-3活性明顯增加。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖刺激48 h、72 h后HK-2細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白水平較HG0h組明顯上升，SIRT1的蛋白表達(dá)較HG0h組明顯減少。高糖刺激48 h、72 h后HK-2細(xì)胞的SIRT1脫乙?；钚悦黠@減少。Western blot結(jié)果顯示48 h、72 h后HK-2細(xì)胞的乙酰化P53的蛋白水平明顯增多，但P53的蛋白水平?jīng)]有變化。<

23、br>　　2.5白藜蘆醇對(duì)高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中凋亡指標(biāo)及SIRT1脫乙酰化活性的影響
　　MTT結(jié)果顯示低糖狀態(tài)下白藜蘆醇(5μM，10μM，25μM)干預(yù)對(duì)HK-2細(xì)胞的細(xì)胞存活率沒有影響，但是高糖狀態(tài)下25μM白藜蘆醇治療可以顯著增加HK-2細(xì)胞的存活率。與HG組相比，白藜蘆醇干預(yù)組HK-2細(xì)胞中JC-1染色結(jié)果顯示線粒體膜電位顯著升高、Hoechst33258染色結(jié)果顯示細(xì)胞核分裂顯著減少、caspase-3活性顯著降

24、低。Western blot結(jié)果示，白藜蘆醇干預(yù)顯著減少高糖誘導(dǎo)的cleaved caspase-3及cleaved PARP的蛋白水平。與HG組相比，白藜蘆醇干預(yù)使HK-2細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)及脫乙酰化活性顯著升高，并且減少乙?；疨53的蛋白含量，但是對(duì)P53的蛋白含量無明顯變化。結(jié)果還顯示在低糖和甘露醇組，以上指標(biāo)的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.6 SIRT1對(duì)高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中凋亡的影響
　　SIRT1 s

25、iRNA轉(zhuǎn)染后使HK-2細(xì)胞SIRT1的蛋白表達(dá)減少60％及基因水平減少65％。CON siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，白藜蘆醇干預(yù)可以顯著改善高糖引起的細(xì)胞核分裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleaved PARP蛋白水平及乙?；疨53蛋白水平的增加，顯著改善高糖引起的線粒體膜電位和SIRT1脫乙?；钚越档?。與CON siRNA轉(zhuǎn)染相比，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞顯示出細(xì)胞核分

26、裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleavedPARP蛋白水平及乙酰化P53蛋白水平的增加，線粒體膜電位和SIRT1脫乙?；钚越档?。但是SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，白藜蘆醇干預(yù)并不能改善高糖引起的以上凋亡指標(biāo)的變化。
　　結(jié)論
　　1.白藜蘆醇治療可以延緩DN的進(jìn)展，降低腎重/體重，改善腎功能。
　　2.白藜蘆醇減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟纖維化。
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