腹腔移植人羊膜上皮細(xì)胞修復(fù)化療損傷卵巢功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用人羊膜上皮細(xì)胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）或人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清(conditioned medium collectedfrom cultured hAECs， hAEC-CM)治療白消安和環(huán)磷酰胺（Busulfan andcyclophosphamide,Bu/Cy）所致卵巢損傷（primaryovarian insufficiency，POI）的小鼠模型，觀察其治療效

2、果。同時(shí)，初步探討hAECs修復(fù)POI小鼠卵巢功能的可能機(jī)制。
　　方法：獲取孕有男性胎兒的剖宮產(chǎn)孕婦的胎盤(pán)羊膜并從中分離hAEC s；將其分為兩部分，第一部分hAECs持續(xù)培養(yǎng)，第二部分hAECs則待其鋪展至80-90％密度時(shí)，將含血清培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集hAECs-CM并進(jìn)行濃縮；將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、Bu/Cy組、Bu/Cy+hAECs(24h)組、Bu/Cy+hAECs-CM(24

3、h)組、Bu/Cy+hAECs(7d)組和Bu/Cy+hAECs-CM(7d)組共6組。其中正常對(duì)照組，不給予任何處理，其余5組則采用腹腔注射化療藥物白消安和環(huán)磷酰胺制作POI小鼠模型。其中Bu/Cy組不經(jīng)任何治療處理，Bu/Cy+hAECs(24h)組于化療24小時(shí)后進(jìn)行腹腔移植hAECs，Bu/Cy+hAECs-CM(24h)組于化療24小時(shí)后進(jìn)行腹腔注射hAECs-CM，Bu/Cy+hAECs(7d)組于化療7天后進(jìn)行腹腔移植hA

4、ECs，Bu/Cy+hAECs-CM(7d)組于化療7天后進(jìn)行腹腔注射hAECs-CM。四個(gè)治療組均于第一次治療后的第二天加強(qiáng)注射一次，共注射兩次。比較各組小鼠體重、卵巢組織形態(tài)學(xué)、各級(jí)卵泡數(shù)量以及交配實(shí)驗(yàn)等結(jié)果的差異，評(píng)估hAEC s和hAECs-CM對(duì)POI小鼠損傷卵巢的治療效果。同時(shí)，通過(guò)巢氏PCR(multiplex nested PCR)檢測(cè)移植hAECs后小鼠卵巢中是否表達(dá)人來(lái)源的Y染色體性別決定基因(sex-determi

5、ning region of Y-chromosome，SRY)。最后分別于化療或治療后2周或者1個(gè)月檢測(cè)各組小鼠卵巢組織中VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)及其受體VEGFR1(Vascular endothelial growth factorreceptor1,也稱為FMS-like tyrosine kinase1，F(xiàn)LT1)和VEGFR2(Vascular endotheli

6、al growth factor receptor2，kinase insert domainprotein receptorkinase insert domainprotein receptor，KDR)的表達(dá)情況以及微血管數(shù)量的變化。
　　結(jié)果：1.成功地構(gòu)建了白消安+環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POI小鼠模型;2.腹腔移植hAECs或腹腔注射hAECs-CM對(duì)POI小鼠進(jìn)行治療后，HE染色結(jié)果顯示POI小鼠各級(jí)卵泡數(shù)量均得到增加，交配后

7、單胎子代小鼠數(shù)量增加；3.化療后24小時(shí)移植hAECs的POI小鼠卵巢內(nèi)可以檢測(cè)到人來(lái)源的SRY基因的表達(dá)，而化療后7天移植hAECs的小鼠卵巢內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到人來(lái)源的SRY基因的表達(dá)；4.Real-time PCR分析結(jié)果顯示化療后2周Bu/Cy組小鼠卵巢組織中VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)降低，VEGFA的表達(dá)升高。而腹腔移植hAECs或hAECs-CM后小鼠卵巢VEGFR1和VEGFR2表達(dá)升高，且免疫組織化學(xué)分析結(jié)果與Real-t

8、ime PCR結(jié)果相似；5.化療后1個(gè)月免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明Bu/Cy組小鼠卵巢組織VEGFA、VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)均降低，而腹腔移植hAECs或hAECs-CM的小鼠其卵巢組織中VEGFA及其受體的表達(dá)均增加。5.化療后2周或1個(gè)月，卵巢組織中微血管數(shù)量均較正常對(duì)照組明顯減少，而腹腔移植hAEC s或hAEC s-C M的小鼠其卵巢中微血管數(shù)量則較Bu/Cy組小鼠明顯增加。
　　結(jié)論：腹腔移植hAECs或腹腔注射

9、hAECs-CM均對(duì)Bu/Cy化療所致POI小鼠的卵巢功能有部分修復(fù)作用，化療后24h給予治療的小鼠其卵巢功能改善效果較化療后7d給予治療的小鼠為佳，且 hAECs-CM對(duì)卵巢的修復(fù)作用與腹腔移植hAECs的修復(fù)效果相當(dāng)。此外hAECs和hAECs-CM治療后1個(gè)月小鼠卵巢中的VEGFA和其受體VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)均較未治療的Bu/Cy組小鼠增加，微血管數(shù)量也明顯增高，表明 hAECs可能是通過(guò)分泌一些因子進(jìn)行旁分泌調(diào)節(jié)血管