紫外線輻射對(duì)皮膚細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、隨著地球臭氧層變薄，紫外線輻射對(duì)人類的傷害越來(lái)越大。皮膚是直接受到紫外線輻射的器官，受到一定劑量的紫外線輻射后，導(dǎo)致了表皮和真皮細(xì)胞的廣泛損傷，最終引起皮膚炎癥反應(yīng)、免疫抑制、皮膚癌變及皮膚光老化。紫外線照射對(duì)皮膚的影響日益成為當(dāng)今世界皮膚學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)此領(lǐng)域的研究目前主要集中在探討上述各病理反應(yīng)的分子機(jī)制方面。 以人類基因組“工作框架圖”完成為標(biāo)志，生命科學(xué)已進(jìn)入了后基因組時(shí)代，生命科學(xué)研究的重心已從揭示生命的

2、所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在分子整體水平對(duì)功能的研究，而生命功能的真正執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此，研究由功能基因編碼和翻譯的蛋白質(zhì)，已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和新的任務(wù)。由此產(chǎn)生了一門新興學(xué)科——蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。 蛋白質(zhì)組是指基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定的時(shí)間和空間上基因組活躍表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的科學(xué)。不同于傳統(tǒng)的單個(gè)蛋白質(zhì)或某一類蛋白質(zhì)研究，蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化

3、規(guī)律的科學(xué)，它是在蛋白質(zhì)水平定量、動(dòng)態(tài)、整體的研究生物體，并由此在更深層次上獲得對(duì)生理、疾病過(guò)程以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛而完整的認(rèn)識(shí)。因而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種整體性、高通量、系統(tǒng)性研究方法。 自1994年澳大利亞學(xué)者提出蛋白質(zhì)組概念以來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)日益成為近幾年來(lái)國(guó)外皮膚學(xué)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)在皮膚方面的研究尚處起步階段，而國(guó)內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)在紫外線對(duì)皮膚作用方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)

4、以及計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理技術(shù)分離和鑒定紫外線誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞差異表達(dá)蛋白，從蛋白質(zhì)水平全面系統(tǒng)地研究紫外線輻射對(duì)皮膚的影響，從而能夠動(dòng)態(tài)、整體、高通量地探討紫外線對(duì)皮膚光損傷的各種發(fā)病機(jī)制及其相互作用途徑，為進(jìn)一步尋找皮膚光損傷的診斷特異性標(biāo)志及藥物防治的靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。 研究分為上下兩篇共六個(gè)部分，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 上篇：皮膚細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的構(gòu)建 第一部分：人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)的建立

5、與優(yōu)化采用體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株，以固相pH梯度——IPG膠條(pH=3～10)進(jìn)行第一向等電聚焦，以SDS(12.5﹪)均一膠進(jìn)行第二向分子量垂直電泳，對(duì)以上雙向凝膠電泳的關(guān)鍵因素與環(huán)節(jié)，如樣品處理、上樣量、電泳參數(shù)、凝膠濃度和SDS凝膠電泳染色方法等進(jìn)行一系列的條件優(yōu)化。結(jié)果：建立并優(yōu)化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析所需的雙向凝膠電泳技術(shù)，成功地得到了重復(fù)性較好的角質(zhì)形成細(xì)胞的雙向凝膠電泳圖譜，并提高了其分辨率。

6、第二部分：皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的比較建立用于皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究的2-DE圖譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離人皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，獲得分辨率高且重復(fù)性較好的人皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的雙向凝膠電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，然后用ImagingMaster2D圖像分析軟件進(jìn)行比較分析，識(shí)別兩者間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果：(1)人皮膚成纖維細(xì)胞凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為685±34，平均匹配的點(diǎn)

7、數(shù)為593±29，匹配率達(dá)86.6﹪；角質(zhì)形成細(xì)胞凝膠平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為592±27，平均匹配的點(diǎn)數(shù)為483±22，匹配率達(dá)81.7﹪。(2)通過(guò)比較分析上述兩種細(xì)胞的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點(diǎn)數(shù)為315±25。差異表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)為281個(gè)，其中117個(gè)點(diǎn)僅在成纖維細(xì)胞中表達(dá)，124個(gè)點(diǎn)僅在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，126個(gè)點(diǎn)在成纖維細(xì)胞中為高表達(dá)，145個(gè)點(diǎn)在成纖維細(xì)胞中為低表達(dá)。上述結(jié)果表明兩種皮膚主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間存在很多差異表達(dá)的

8、蛋白質(zhì)。 第三部分：皮膚細(xì)胞蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析方法的建立及肽質(zhì)量指紋圖譜的構(gòu)建體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離其總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250染色后，在圖譜上選取2個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白點(diǎn)與1個(gè)成纖維細(xì)胞蛋白點(diǎn)，進(jìn)行膠內(nèi)酶切、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果：獲得3個(gè)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)Mascot軟件搜索人非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)后鑒定為細(xì)胞骨架Actin

9、gamma1、tubulinα2及熱休克蛋白HSP70。皮膚細(xì)胞基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析技術(shù)的建立為皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究提供手段。 下篇：紫外線輻射所致皮膚細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的分離與鑒定第四部分：紫外線輻射前后皮膚細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的差異分析采用UVB(30mJ/cm2)照射人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株；UVA(10J/cm2)照射人皮膚成纖維細(xì)胞，用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離UV

10、輻射前后各皮膚細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)銀染顯色后，ImagingMaster2D圖像分析軟件進(jìn)行比較分析，識(shí)別UV輻射前后各皮膚細(xì)胞間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果：(1)UVB輻射前后人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為582±31和595±28，平均匹配的點(diǎn)數(shù)分別為483±29和491±27，匹配率達(dá)82.9﹪和82.5﹪。(2)通過(guò)比較分析UVB輻射前后人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點(diǎn)

11、數(shù)為433±25。差異表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)為44個(gè)，其中5個(gè)點(diǎn)僅在UVB輻射前HaCaT株細(xì)胞中表達(dá)，另15個(gè)點(diǎn)僅在UVB輻射后HaCaT株細(xì)胞中表達(dá)；15個(gè)點(diǎn)在UVB輻射后HaCaT株細(xì)胞中高表達(dá)，9個(gè)點(diǎn)在UVB輻射后HaCaT株細(xì)胞中低表達(dá)。(3)UVA輻射前后人皮膚成纖維細(xì)胞凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為676±21和693±28，平均匹配的點(diǎn)數(shù)分別為583±29和591±27，匹配率達(dá)86﹪和85﹪。(4)通過(guò)比較分析UVA輻射前后人皮膚成

12、纖維細(xì)胞的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點(diǎn)數(shù)為563±19。差異表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)為17個(gè)，其中1個(gè)點(diǎn)僅在UVA輻射前成纖維細(xì)胞中表達(dá)，另4個(gè)點(diǎn)僅在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中表達(dá)；7個(gè)點(diǎn)在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，5個(gè)點(diǎn)在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中低表達(dá)。上述結(jié)果表明UV輻射前后皮膚細(xì)胞間存在一些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，以上差異點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究紫外線對(duì)皮膚的影響提供了有益的線索。 第五部分：紫外線輻射前后皮膚細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜

13、鑒定和分析分別提取30mJ/cm2UVB照射前后角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株和10J/cm2UVA照射前后成纖維細(xì)胞的總蛋白，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分離，染色后經(jīng)ImagingMaster2D軟件分析雙向電泳圖譜以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白，并對(duì)部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行膠內(nèi)酶切、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果：獲得角質(zhì)形成細(xì)胞22個(gè)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖，以及成纖維細(xì)胞17個(gè)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖。經(jīng)Mascot等

14、軟件搜索人非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)后初步鑒定為一些與細(xì)胞骨架、應(yīng)激保護(hù)、能量代謝、物質(zhì)合成分解、細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控相關(guān)的蛋白，包括：熱休克70蛋白A5，熱休克70蛋白9B，熱休克60蛋白，微管蛋白α2和微管蛋白β5，角蛋白K7、K8、K13、K18和K19，醛縮酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸甘油酸變位酶，烯醇化酶，蛋白酶體α4，蛋白酶體α1，60s酸性核糖核蛋白體蛋白P0，PDLIM1，蛋白酶抑制因子5，硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶，PHB，翻譯延伸因子，

15、鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅰ，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，組織蛋白酶B前蛋白酶原，泛素羧基末端水解酶1，F(xiàn)LJ00340蛋白，DJ1蛋白。對(duì)它們的功能和與紫外線輻射的可能關(guān)系進(jìn)行了初步探討。上述結(jié)果表明紫外線輻射可以誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，而這些蛋白的變化與皮膚細(xì)胞應(yīng)對(duì)紫外線輻射并清除其損傷密切相關(guān)。 第六部分：紫外線輻射前后皮膚細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的Western免疫印跡法鑒定分別提取UVA輻射前后皮膚成纖維細(xì)胞及UVB輻射前后角質(zhì)形成細(xì)胞HaC

16、aT株的總蛋白，采用Western免疫印跡法對(duì)HSP70kDaA5、HSP70KDa9B、及HSP60；角蛋白K7、K18和K19；醛縮酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇化酶進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：(1)熱休克蛋白HSP70kDaA5及熱休克蛋白HSP70KDa9B在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中表達(dá)均增高；烯醇化酶1在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中表達(dá)下降；角蛋白K7在UVA輻射后成纖維細(xì)胞中表達(dá)增高；(2)熱休克蛋白HSP70KDa9B及熱休克蛋白HSP60在

17、UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中表達(dá)均增高；角蛋白K18和K19在UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中表達(dá)均增高；醛縮酶，磷酸甘油酸變位酶，烯醇化酶1在UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中表達(dá)均明顯下降。以上結(jié)果與先前二維電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了本研究發(fā)現(xiàn)的紫外線所致皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)變化。 綜上所述，本研究首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)以及計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理技術(shù)分析和鑒定紫外線誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)了很多差異表達(dá)蛋白